非复制型腺病毒携带制备的人纤维介素微小RNA在肝癌的体内、外效应研究

摘要

【背景/目的】
　　纤维蛋白原样蛋白2[Fibrinogen-like protein2(fgl2)/fibroleukin]（FGL2），也称为纤维介素、fgl2凝血酶原酶，属于纤维蛋白原相关蛋白超家族成员中的一员，具有丝氨酸酶的活性。fgl2有跨膜型和可溶型两种存在形式。跨膜型fgl2主要分布在肿瘤细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞表面，通过91位丝氨酸位点，裂解凝血酶原酶生成凝血酶，一方面将纤维蛋白原催化交联形成纤维蛋白，为肿瘤生长提供支架，另一方面通过蛋白酶激活受体（protease-activated receptors,PARs），传递MAPK/ERK信号，促进相应细胞的增殖和炎性因子、促血管生成因子的分泌。我们前期研究已成功构建携带自行制备的人纤维介素微小RNA的非复制型腺病（Ad-hfgl2-miRNA），本研究旨在研究Ad-hfgl2-miRNA对人肝癌细胞增殖的影响，进而进行Ad-hfgl2-miRNA干预裸小鼠人肝癌皮下移植瘤的体内效应研究。
　　【方法】
　　1.采用流式细胞术检测人肝癌细胞系LM3、Huh7和PLC的hfgl2表达。
　　2.采用流式细胞术检测LM3、Huh7和PLC细胞腺病毒受体（coxsackie and adenovirus receptor，CAR）表达。
　　3.不同浓度腺病毒感染LM3、Huh7、PLC细胞，确定其感染这三种细胞的最佳感染复数(multiplicity of infection，MOI)，采用Western-Blot方法检测hfgl2蛋白的表达。
　　4.采用CCK-8试剂盒法检测Ad-hfgl2-miRNA对LM3、Huh7、PLC细胞增殖的影响。
　　5.建立HCCLM3裸小鼠人肝癌皮下移植瘤模型，当肿瘤体积达到约100-150 mm3时，将裸鼠随机分为三个组，干预组采用瘤内注射1×109IU Ad-hfgl2-miRNA腺病毒颗粒，阴性对照组、空白组分别注射1×109IU Ad-neg-miRNA和相同体积PBS，每周干预一次，一共四次，每2-3天测量一次肿瘤的大小直到治疗终点，并计算肿瘤体积、相对肿瘤体积及相对肿瘤增殖率。
　　6.治疗终点时，剥离肿瘤称重，收集瘤组织进行组织学、免疫组织化学和Western blot实验，检测肿瘤组织中hfgl2蛋白和新生血管内皮细胞的表面标志物CD31分子的表达，并计算瘤组织中微血管密度MVD。
　　【结果】
　　1.流式细胞术检测hfgl2在 LM3、Huh7、PLC三种人肝癌细胞均有表达，表达hfgl2的LM3、Huh7、PLC细胞分别为17.3％、55.4%和28.5%。
　　2.流式细胞术检测表达CAR的LM3、Huh7、PLC细胞分别为7.7%、11.6%和7.3%，在三种人肝癌细胞株中CAR低表达。
　　3.腺病毒感染LM3、Huh7、PLC细胞最佳感染复数分别为200、400、200；在细胞水平，Ad-hfgl2-miRNA对目的蛋白hfgl2具有明显的抑制效应。
　　4. CCK-8实验表明：不同MOI的Ad-hfgl2-miRNA腺病毒颗粒感染LM3、Huh7、PLC细胞，对细胞的增殖具有显著地抑制作用，并且抑制率呈剂量依赖关系，与阴性对照相比，Ad-hfgl2-miRNA具有更强的抑制作用，二者比较有统计学差异。以上结果表明，干预hfgl2基因可以抑制LM3、Huh7、PLC细胞的增殖。
　　5.成功建立了HCCLM3裸小鼠人肝癌皮下移植瘤模型，干预第10天时，干预组平均肿瘤体积小于非相关对照和空白对照组（147.78±46.32mm3vs333.93±100.58mm3，P<0.01；147.78±46.32mm3vs479.45±106.56mm3，P<0.01）；治疗第23天时，干预组和非相关对照、空白对照组相比，肿瘤体积仍显著减小（201.68±111.01mm3vs814.4±419.7mm3，P<0.05；201.68±111.01mm3vs1246.35±394.08mm3，P<0.05）；治疗终点时，干预组、非相关对照和空白对照组平均肿瘤重量分别为0.069g±0.018g、0.496g±0.213g和0.564g±0.147g，干预组肿瘤的重量小于非相关对照和空白对照组（P<0.05）。结果显示Ad-hfgl2-miRNA对HCCLM3裸小鼠人肝癌皮下瘤的生长具有显著地抑制作用。
　　6.Western blot结果显示：干预组和非相关对照、空白对照组相比，肿瘤组织中hfgl2蛋白表达明显减少。免疫组织化学结果显示：干预组和对照组相比，血管新生标志物CD31表达明显降低。结果表明瘤内注射Ad-hfgl2-miRNA可显著下调hfgl2蛋白的表达，减少肿瘤血管新生，从而抑制人肝癌皮下移植瘤的生长。
　　【结论】
　　1. Ad-hfgl2-miRNA腺病毒颗粒对人肝癌细胞LM3、Huh7、PLC具有显著地增殖抑制作用。
　　2.携带hfgl2 RNA干扰序列的非复制型腺病毒可有效的下调hfgl2蛋白的表达，减少肿瘤血管新生，抑制肿瘤的生长。为临床药物的开发和肝癌治疗提供了新思路。

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前言

第一部分 非复制型腺病毒携带制备的人纤维介素微小RNA对人肝癌细胞的增殖抑制作用

材料与方法

结果

讨论

第二部分 非复制型腺病毒携带制备的人纤维介素微小RNA干预裸小鼠人肝癌皮下移植瘤的体内效应研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述: 基因治疗在肝癌治疗中的研究现状和进展

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