木瓜蛋白酶具有水解壳聚糖活性的酶组分分离纯化研究

摘要

木瓜蛋白酶能非专一性地水解壳聚糖，但其水解壳聚糖的作用方式和水解机理等方面仍不清楚。本论文研究木瓜蛋白酶具有水解壳聚糖活性成分的分离和纯化，对于进一步阐明非专一性酶水解壳聚糖的作用机理具有重要的学术意义，同时对于酶法生产甲壳低聚糖具有重要的应用价值。 首先对五种商品木瓜蛋白酶制剂降解壳聚糖的活性进行比较，从中筛选出一种降解壳聚糖活性较高的木瓜蛋白酶Ⅱ，作用于不同脱乙酰度壳聚糖的结果表明，此酶的最佳底物是壳聚糖Ⅰ，脱乙酰度为85.7％。木瓜蛋白酶Ⅱ降解壳聚糖的最适条件是底物浓度0.5％、pH4.0、40℃、酶底物比10％。在最适条件下木瓜蛋白酶Ⅱ降解壳聚糖时，30min 内导致粘度下降百分比达到70.77％，1h之后粘度变化平缓。采用Sepharose CL-6B 凝胶柱测定木瓜蛋白酶Ⅱ降解壳聚糖6h 和加灭活酶反应产物相对分子质量分布，结果显示木瓜蛋白酶Ⅱ降解壳聚糖产物的相对分子质量主要集中在11943 到2899；加灭活酶反应产物的相对分子质量主要集中在35490 到10162。 采用截留相对分子质量为10000 的中空纤维膜对木瓜蛋白酶Ⅱ进行超滤浓缩分离，室温下最佳操作压力为0.1MPa，超滤浓缩倍数为8 倍时，可以得到最高具有壳聚糖酶活性的组分。超滤后木瓜蛋白酶Ⅱ的蛋白酶和壳聚糖酶比活力分别从435.10U/mg 和2.17U/mg 提高到531.39U/mg 和2.65U/mg，纯化倍数均提高了1.22 倍。SDS-PAGE 图谱显示，超滤去除了相对分子质量小于10000 的杂蛋白，其纯度得以提高。成分分析表明，超滤后的木瓜蛋白酶制剂中还原糖含量由57.46％降至6.27％。 采用制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化超滤后的木瓜蛋白酶Ⅱ，胶浓度为10％的分离胶、4％的浓缩胶。制备电泳图谱上显示有五条明显的酶条带，酶活性测定显示条带2 具有较高的壳聚糖酶活性，对该条带进行富集获得具有壳聚糖酶活性的单一酶组分。采用SDS-PAGE 和HPLC 对此纯化酶组分进行纯度鉴定，结果显示为单一条带和单一峰，说明木瓜蛋白酶Ⅱ中存在具有水解壳聚糖的酶组分。LC-MS/MS 测定该纯化酶组分的氨基酸序列为MRITISGSPGSGTTTLGRSI AEKYSYRYVS AGEVFRGLAK ERNMDLAAFG KIAETDPAIDLEIADARQKEI GESSDDIILE GRLAGWMVEN ADLKILLCAS PECRSTRIAAREGLTEKQAF EMTIEREACE AGRYMEYYEI DILDFSPYDL ILNSETFSANELFAIVDAAV SSLLKRE，共有177 种氨基酸。