mIFN-λ3真核表达载体的构建及其在HBV复制小鼠模型上抗病毒机制研究

摘要

目的:
　　2003年国外两个独立的研究小组，发现一组新型干扰素即IFN-λ家族，包括IFN-λ1(IL-29)，IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)。其与相应的受体结合可以激活JAK-STAT信号通路从而发挥抗病毒感染、抗肿瘤及免疫调节的作用。相比IFN-α，IFN-λ作用于肝细胞后，肝细胞内JAK-STAT信号通路中关键分子STAT1/2磷酸化时间明显延长。且其受体在血液系统和神经系统分布明显少于IFN-α，所以有望用于临床上IFN-α治疗副作用大或无应答的患者。
　　本研究拟通过构建小鼠IFN-λ3真核表达质粒，检测mIFN-λ3的表达情况。并将构建好的质粒通过高压尾静脉注射的方法，注入小鼠体内，研究其在小鼠体内是否能发挥抗HBV作用及其相关机制，为IFN-λ用于临床治疗慢性乙肝患者提供理论依据。
　　方法：
　　1、构建小鼠IFN-λ3（mIFN-λ3）的质粒，设计特异性引物，通过 PCR扩增小鼠IFN-λ3编码区全长，将其克隆至克隆载体pMD18-T载体进一步扩增。
　　2、将pMD18-T-mIFN-λ3及真核表达载体pIRES2-EGFP分别用限制内切酶salⅠ和BamHⅠ双酶切后，再用DNA连接酶进行连接，构建双顺反子表达载体pIRES2-EGFP-mIFN-λ3（pmIFN-λ3）。
　　3、使用脂质体Lipofectamine2000将构建好的表达载体pIRES2-EGFP-mIFN-λ3转染BHK细胞及通过高压尾静脉注射至小鼠体内，检测mIFN-λ3的表达。
　　4、收集BHK-IFN-λ3的培养上清中表达的mIFN-λ3，检测其抗肿瘤细胞增殖及抗病毒生物学活性。
　　5、通过高压尾静脉注射pAAV-HBV1.2质粒构建小鼠HBV复制模型，同时分别高压尾静脉注射pmIFN-λ3、pmIFN-α4、pmIFN-λ3联合pmIFN-α4，观察pmIFN-λ3及其联合pmIFN-α4在小鼠HBV复制模型中抗HBV作用。
　　6、使用ELISA方法，检测不同时间点小鼠体内mIFN-λ3、mIFN-α4、HBsAg、HBeAg表达情况。
　　7、使用HE染色的方法检测各组不同时间点小鼠肝脏炎症变化。
　　8、收集小鼠血清及肝脏总DNA，使用实时定量PCR（RT-qPCR）检测小鼠血清及肝脏中HBVDNA的变化。
　　9、提取小鼠肝脏总RNA，利用特异性引物进行RT-qPCR，检测肝内转录因子IRF3、IRF5、IRF7、ISG15、USP18、MX1及OAS的变化情况。
　　结果：
　　1、成功构建双顺反子表达质粒pIRES2-EGFP-mIFN-λ3，经PCR、双酶切及测序鉴定，与已知的序列完全吻合，并且成功表达mIFN-λ3。
　　2、pIRES2-EGFP-mIFN-λ3瞬时转染能在BHK细胞中高效表达，24h细胞上清中mIFN-λ3浓度高达1750pg/ml，并可以维持表达高峰至72h。
　　3、BHK细胞瞬时转染表达的mIFN-λ3，能有效抑制A549细胞的增殖，并且具有抗EMCV病毒的保护作用。
　　4、mIFN-λ3在小鼠乙肝复制模型中，可以抑制小鼠血清中HBsAg的表达至15dpi（days post injection，注射后天数），抑制血清中HBeAg的表达至20dpi，抑制血清中HBV DNA的表达至30dpi；而IFN-λ3联合IFN-α4可以抑制小鼠血清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA的表达至30dpi，但是不能抑制肝脏中HBV DNA的复制。
　　5、小鼠HBV复制模型各时期各组小鼠肝脏汇管区可见不同程度的炎症表现。其中以HBV1.2组及HBV1.2+mIFN-λ3组较为明显，提示IFN-α4及IFNλ3+IFN-α4具有良好抑制炎症细胞浸润的作用，而单独IFN-λ3则作用不明显。
　　6、mIFN-λ3单独作用时，肝内IRF3、IRF5、IRF7、ISG15、USP18、OAS及MX1较HBV1.2组轻度升高，但均无统计学差异；mIFN-λ3联合mIFN-α4作用时，dpi24h可见肝内IRF7、ISG15、USP18、OAS及MX1较其他各组有均明显升高，且dpi20d、30d及60d均有不同程度的升高，提示mIFN-λ3联合mIFN-α4在HBV小鼠复制模型中可通过激活JAK-STAT信号通路发挥一定的抗HBV效应。
　　结论：
　　1、本实验成功构建小鼠IFN-λ3的表达质粒（pIRES2-EGFP-mIFN-λ3），可以在BHK细胞和小鼠肝脏中高效表达。
　　2、BHK瞬时转染表达的mIFN-λ3具有抑制A549肿瘤细胞增殖及抗EMCV病毒的保护作用。
　　3、在小鼠HBV复制模型中，共注射pAAV-HBV1.2及pmIFN-λ3组与单独注射pAAV HBV1.2组进行比较，mIFN-λ3明显抑制HBV复制的作用维持至15dpi。
　　4、在小鼠HBV复制模型中，mIFN-λ3联合mIFN-α4与单独注射pAAV-HBV1.2组进行比较，血清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA的表达明显受到抑制，且肝内的IRF3, IRF5, IRF7, ISG15, USP18, OAS and MX1等干扰素刺激因子及抗病毒蛋白的表达升高，说明两者联合可以通过激活JAK-STAT信号通路发挥抗HBV的作用。
　　创新点及不足：
　　1、构建mIFN-λ3表达质粒，通过慢性小鼠乙肝模型，研究mIFN-λ3及其联合IFN-α4在此模型上抗HBV作用及机制。
　　2、mIFN-λ3高压尾静脉注射体内很快清除，不能维持小鼠体内mIFN-λ3持续表达，从而持续发挥抗病毒作用。
　　3、mIFN-λ3注射至小鼠体内的量，是否还需要加大，有待进一步研究。
　　4、高压尾注射mIFN-λ3及mIFN-α4，dpi30d-60d小鼠体内的HBsAg、HBV DNA持续高于对照组。其具体机制不明确，有待深入研究。

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前言

第一部分 mIFN mIFNmIFN-λ3真核表达质粒的构建及其表达产物的生物学活性分析

1.实验材料

2.实验方法：

3.实验结果

4.讨论

第二部分 研究mIFN-λ3在高压水注射乙肝小鼠模型中抗HBV机制

1.实验材料：

2.实验方法：

3.实验结果

4.讨论

参考文献

综述:IFN-λ在抗HBV及HCV临床应用中的最新进展

致谢