双酚A对成年雄性大鼠生殖系统蛋白乙酰化修饰的影响

摘要

目的：双酚A(BPA)是一种典型的环境内分泌干扰物（EDC），具有类雌激素或拮抗雄激素的效应。近年来在“安全”剂量下，仍然有报道发现BPA父代暴露能通过雄性生殖系DNA甲基化修饰引起子代功能变化。但是，这样的BPA暴露能否通过另一种重要的表观遗传修饰途径—蛋白乙酰化修饰发挥同样的作用还尚无研究。结合本课题组之前的研究，父代大鼠“安全”剂量的BPA暴露不仅能引起父代的空间记忆行为损伤，并且能够对子代造成同样的影响，本次研究旨在探讨“安全”剂量BPA暴露是否对成年雄性大鼠生殖系蛋白乙酰化修饰造成影响，并对其可能的潜在分子机制进行初步的探索。
　　方法：SPF级成年雄性Wistar大鼠20只（150-180g）。适应性喂养一周后，随机等分为2组，分别摄入普通对照饲料和50μg/kg/day双酚A（BPA）饲料。全部大鼠持续干预35周，计算每日食物摄入量，并且每周记录各组大鼠体重。全部大鼠在干预35周后处死。取睾丸、附睾计算脏器系数。取一侧附睾组织切开孵育精子，取附睾液均匀涂布在载玻片上，计算精子畸形率。其余所需组织-80℃保存备用，部分采用石蜡包埋处理备用。采用伊红-苏木素染色（HE-staining）睾丸石蜡切片观察两组大鼠睾丸组织学形态。TUNEL法处理睾丸石蜡切片后，在荧光显微镜下观察两组大鼠睾丸组织DNA断裂及细胞凋亡的状况。用免疫印迹（western blot, WB）法检测两组大鼠肾脏（体细胞组织）和睾丸（生殖器官组织）蛋白泛乙酰化水平的变化。同时用WB检测睾丸组织重要蛋白组蛋白H3，H4乙酰化水平，以及组蛋白去乙酰化酶Sirtuin-1(Sirt1)、窖蛋白-1（Caveolin-1，Cav-1）以及雌激素受体（ERα、ERβ和GPER）的蛋白表达水平。用免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）检测Cav-1蛋白乙酰化水平,以及Cav-1与Sirt1、ERβ的结合水平及其相互作用的关系。
　　结果：1.与对照组相比，BPA组大鼠体重和脏器系数没有明显变化（P>0.05）.2.与对照组相比，HE染色BPA组大鼠睾丸组织形态没有明显差异；TUNEL法没有发现异常凋亡；精子畸形率两组也没有明显差别（P>0.05）。3.与对照组相比，无论在大鼠肾脏组织还是睾丸组织，BPA组蛋白泛乙酰化水平明显下降，特别是在17kDa和25kDa分子量附近。4.与对照组相比，BPA组的组蛋白H3K9，H3K27和H4K12的蛋白乙酰化水平明显下降（P<0.05），其中组蛋白H3分子量为17KD，与泛乙酰化结果一致。同时组蛋白去乙酰化酶Sirt1的蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。5.与对照组相比，BPA组Cav-1蛋白表达水平并没有明显改变（P>0.05），但是其蛋白乙酰化水平明显下降（P<0.05）。其蛋白分子量为~22kDa，这一结果与泛乙酰化结果一致。6.与对照组相比，BPA组雌激素受体ERα和GPER的蛋白表达水平没有明显差别（P>0.05），但ERβ蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。7.与对照组相比，免疫共沉淀结果显示BPA组与Cav-1结合的ERβ表达明显升高（P<0.05），同时与Cav-1结合的Sirt1表达明显下降（P<0.05）。
　　结论：1.本实验条件下，“安全”剂量BPA暴露没有直接引起大鼠生殖系统器质性损伤及生殖功能的影响。2.“安全”剂量BPA暴露可能同时引起大鼠体细胞组织（肾脏）和生殖系统（睾丸）蛋白乙酰化水平的改变，并且其生殖系统（睾丸）蛋白乙酰化水平的改变可能是BPA引起继代遗传现象的原因。3.“安全”剂量BPA暴露引起的蛋白乙酰化水平下降可能与其类雌激素作用有关。这一机制中可能的关键蛋白包括Cav-1，Sirt1，和ERβ。
　　创新点：1.首次从蛋白乙酰化角度探索BPA的雄性生殖遗传和对表观遗传学的影响。2.首次从BPA类雌激素效应方面探索其表观遗传学机制。

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中文摘要

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前言

第一部分 “安全”剂量BPA暴露对雄性大鼠生殖系统的损伤

1. 前言

2. 材料与方法

3. 结果

4. 讨论

第二部分 双酚A对大鼠蛋白乙酰化的影响及其机制

1. 前言

2. 材料与方法

3. 结果

4. 讨论

参考文献

综述: 双酚A继代表观遗传效应中的表观遗传机制

附录：研究生工作小结

致谢