p300 100kD降解片段通过μ型钙蛋白酶产生并促进神经细胞分化发育

摘要

神经发育是一个通过大量基因在时间和空间上非常精密地表达而被调控的复杂过程。这些基因的表达异常可导致神经发育紊乱。染色质结构能够整合细胞内、外环境的信息引发特定的表型产生，是一种调节基因精确表达的关键机制。组蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferases，HATs）是以空间和时间依赖性形式调控基因表达水平的蛋白家族之一，其通过乙酰化修饰作用可使染色质结构发生动态改变，并对基因的转录产生相应的影响。p300作为一种HAT，调控全身各组织中多种基因的转录活性，特别在细胞周期进程和细胞分化中发挥重要功能。除了具有乙酰转移酶结构域，p300还含有许多保守功能结构域通过与其它细胞蛋白相互作用。p300的基本功能是作为HAT或FAT，以及充当转录因子和基本转录装置中其它原件之间的三角架及桥架，易化染色质重构并激活基因转录，能对神经元中p53羧基末端特异赖氨酸位点乙酰化而促进突起的生长并为轴突再生所必需。p300与另一种HAT即CREB结合蛋白（CREB-binding protein，CBP）非常相似，二者对细胞周期调控、凋亡、胚胎发育、细胞分化和肿瘤发生等多种活动都有影响，并是胚胎发育，特别是神经发育中均是必不可少的调控因子。然而，二者也具有一些不同的功能，p300在神经分化发育中的作用不能被CBP所替代。
　　尽管p300在胚胎干细胞和畸胎瘤细胞F9细胞分化中必不可少，但是，在诱导胚胎干细胞拟胚胎形成的分化时，p300 mRNA水平升高但其蛋白水平下降；在视黄酸（retinoic acid，RA）诱导F9分化过程中，p300的HAT活性显著增加，但其蛋白水平却显著降低，表明在分化过程中p300被大量降解。p300蛋白水平下降与泛素蛋白酶体系统降解有关，但p300下降后伴随的HAT活性增强促进细胞分化是否与泛素蛋白酶体系统途径降解有关尚不确定。在急性髓性白血病中，CBP/p300发生降解，而钙蛋白酶的特异性抑制剂能够阻断 CBP/p300的下降，表明p300可被钙蛋白酶降解。
　　本研究在证明小鼠脑组织和小鼠成神经瘤细胞（N2a细胞）分化发育过程中p300 mRNA表达逐渐增加而全长p300蛋白逐渐减少的基础上，首次检测到在神经元分化过程中，p300可被μ型钙蛋白酶特异性剪切而产生大量的约100kD大小的氨基末端片段，并初步证明该片段具有比全长p300更强的促神经细胞分化作用。
　　1.小鼠胚脑和 N2a细胞分化发育过程中p300水平逐渐下降为了明确在神经系统分化发育过程中存在p300转录水平升高的同时蛋白水平下降这一现象，首先，我们提取E9.5至E16.5小鼠胚胎全脑的蛋白，检测小鼠胚胎脑分化发育过程中 p300蛋白水平的变化趋势。结果显示，在小鼠胚胎 E9.5至 E15.5期间，p300的蛋白水平则逐渐下降。继而，我们对N2a细胞用RA诱导分化0-48h后，应用RT-PCR和Western blot技术检测到p300 mRNA和蛋白水平，发现随着诱导时间的延长，p300 mRNA逐渐升高而蛋白质水平下降。以上结果说明，在神经组织或神经细胞分化发育过程中，同样存在p300转录水平升高同时蛋白表达水平下降现象。
　　2.小鼠胚脑和 N2a细胞分化发育过程中全长 p300蛋白水平下降而 p300100kD裂解片段升高在小鼠胚脑和N2a细胞分化发育过程中，p300表达水平逐渐下降的现象体提示，p300在神经分化中可能被大量降解。为此，应用识别p300氨基末端的抗体对不同胚龄小鼠脑组织和经 RA诱导不同时间的N2a细胞中全长p300（full length p300, FL-p300）及其降解产物的水平变化情况进行Western blot检测。结果显示，在约100kD大小处可见一明显降解片段——p300100kD片段（100kD fragment of p300,100kD p300）。该降解片段水平在E9.5至E12.5脑中以及RA诱导分化的0至2d的N2a细胞中随着FL-p300水平的逐渐降低而上升；在E13.5至E16.5期间，则与FL-p300同步下降。
　　3.产生100kD p300的裂解位置在p300氨基酸726-1020区域100kD p300能被识别 p300氨基末端的抗体识别，根据分子量计算其产生位置应在 p300氨基末端1/3处。由于p300的同源蛋白CBP在细胞分化过程中没有类似于p300基因转录增加而蛋白水平降低的现象，且尽管CBP和p300的序列一致性高达60％，但在氨基末端1/3处二者序列相似度很低，因此我们以同源蛋白CBP做对照来确定100kD p300的裂解位置。根据CBP和p300的氨基末端1/3处可能裂解位置处的氨基酸序列，构建表达FL-p300裂解位点竞争性底物的质粒，转染N2a后用RA诱导36h。Western blot检测显示，转染表达CBP(aa777-974)短片段（CBP short fragment，CBP S）和CBP（aa726-1020）长片段（CBP long fragment，CBP L）的细胞，100kD p300的产生与转染表达HA的细胞无明显区别，而转染表达p300（aa777-974）短片段（p300 short fragment，p300 S）和p300（aa726-1020）长片段（p300 long fragment，p300 L）的细胞，100kD p300的产生较转染表达HA的细胞减少，即p300 S和p300 L能抑制RA诱导分化过程中100kD p300的产生，且以p300 L的抑制作用更明显。对 RA诱导 N2a细胞突起生长（神经细胞分化的标志之一）作用的比较显示，p300 S和p300 L对RA诱导的N2a突起生长也具有抑制作用，并以p300 L的抑制作用更显著。由此表明，产生100 kD p300的裂解位置在p300氨基酸726-1020区域，并提示p300在此区域的裂解可促进神经细胞的分化。
　　4.μ型钙蛋白酶是产生100kD p300的剪切酶为了寻找产生100kD p300的剪切酶，首先观察了蛋白酶体抑制剂MG132和钙蛋白酶抑制剂calpeptin对分化诱导N2a细胞产生100kD p300的影响。在5%FBS完全培养基培养的未分化N2a细胞中，MG132和calpeptin对p300的降解和100 kD p300的产生没有影响，而在含RA培养基培养的N2a细胞中，MG132虽可阻断p300的降解，却不影响100kD p300的产生；而calpeptin抑制FL-p300降解的同时也抑制了100kD p300的产生。由此说明calpain是100kD p300产生的剪切酶。
　　根据激活时所需 Ca2+浓度数量级不同，钙蛋白酶家族分为μ型钙蛋白酶（微摩尔级）和m型钙蛋白酶（毫摩尔级）两类。为了明确μ型钙蛋白酶和m型钙蛋白酶对p300的剪切及100kD p300的产生是否具有不同的影响，使用5μmol/L和5 mmol/L两种数量级浓度的Ca2+分别激活体外的μ型钙蛋白酶和m型钙蛋白酶来比较两种钙蛋白酶对小鼠E13.5胚胎全脑蛋白中p300裂解的差异。免疫印迹技术检测显示，随着浓度的升高，m型钙蛋白酶虽然可促进FL-p300裂解，但对100kD p300的产生没有影响，而μ型钙蛋白酶既可促进FL-p300的裂解也可促进100kD p300的形成，其最适浓度范围为0.01 U/μl~0.02 U/μl。当在加入0.003 U/μl或0.01 U/μl的μ型钙蛋白酶同时加入10μmol/L calpeptin，对FL-p300的剪切被明显抑制，尤其是对0.01 U/μlμ型钙蛋白酶抑制效果更为明显。因此，μ型钙蛋白酶是产生100kD p300的剪切酶。
　　在N2a细胞转染表达氨基末端链接标签HA的p300后提取蛋白，用μ型钙蛋白酶进行酶切，用HA标签抗体进行Western blot检测发现，μ型钙蛋白酶剪切p300产生的100kD p300片段带有HA标记，加入calpeptin可抑制带HA的100kD片段产生。因此，μ型钙蛋白酶对p300进行剪切的位点位于p300氨基末端1/3处。
　　进一步应用Western blot对发育过程中小鼠胚胎脑蛋白中μ型钙蛋白酶水平的变化进行检测显示，从E9.5至E15.5，脑内μ型钙蛋白酶激活型大亚基水平逐渐升高，表明胚胎发育过程中100kD p300产生的逐渐增加与μ型钙蛋白酶活性逐渐增强有关。
　　5.100kD p300促进N2a细胞的分化发育为了了解分化发育中FL-p300被剪切产生100kD片段的可能功能意义，继而分析了过表达不同p300片段对N2a细胞分化发育的影响。结果显示，过表达p300氨基末端片段（aa9-1007，p300 N）能显著促进N2a细胞突起的生长和GAP43蛋白水平上升；过表达p300羧基末端片段（aa1006-2414，p300 C）可促进N2a细胞中p53乙酰化，但对N2a细胞突起生长和GAP43蛋白水平上升无明显影响。而共同过表达p300 N和p300 C，其促进突起生长和 GAP43蛋白水平上升的作用较弱，与过表达全长 p300类似或略弱于全长p300，明显弱于p300 N；促进p53乙酰化的作用强于全长p300，但明显低于p300 C。由此表明，p300促进神经分化的功能主要由p300氨基末端100kD片段完成，p300羧基末端片段具有较强的促乙酰化功能，全长p300促分化与乙酰化功能均较弱。
　　结论：在神经分化发育过程中，乙酰转移酶p300被μ型钙蛋白酶在p300氨基末端1/3处剪切产生约100kD片段，剪切位点位于氨基酸726-1020区域；p300促进神经细胞分化的作用主要依靠由μ型钙蛋白酶特异性剪切产生氨基末端100kD片段来完成，发挥乙酰化作用主要通过其羧基末端片段实现，全长p300促进神经细胞分化和乙酰化作用均较弱。

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前言

材料方法

1. 实验动物

2. 细胞

3. 质粒和菌株

4. 抗体

5. 其他主要试剂

6. 细胞培养

7. 质粒转染

8. N2a细胞分化率及突起生长分析

9. 蛋白与RNA标本制备

10. 蛋白质免疫印迹技术

11. RT-PCR及qPCR

12. 钙蛋白酶体外酶切实验

13. 统计学分析

结果

1. 小鼠胚脑和N2a细胞分化发育过程中p300表达水平逐渐下降

2. 小鼠胚脑和 N2a 细胞分化发育过程中全长 p300 蛋白水平下降而 p300 100kD裂解片段升高

3. 产生100kD p300的裂解位置在p300氨基酸726-1020区域

4.μ型钙蛋白酶是100kD p300裂解片段产生的剪切酶

5. 100kD p300促进神经细胞的分化发育

讨论

参考文献

综述: CBP/p300在神经发育和疾病中的作用

附录

攻读博士期间发表论文及会议报告

致谢