肿瘤干细胞致敏的树突状细胞疫苗靶向肿瘤干细胞的效果及相关机制

摘要

第一部分：ALDHhigh CSC-DC疫苗抗肿瘤免疫作用的体内研究
　　目的： ALDHhigh肿瘤细胞是高纯度的、富集肿瘤干细胞（CSCs）的细胞群。在免疫功能正常的小鼠中，SCC7 ALDHhighCSCs致敏的树突状细胞疫苗（ALDHhigh CSC-DC疫苗）和D5 ALDHhigh CSC-DC疫苗均具有显著的抑瘤、抗瘤作用。本实验主要探讨在SCC7外科手术联合治疗模型中，SCC7 ALDHhigh CSC-DC疫苗联合手术切除肿瘤的治疗方法对原位肿瘤的复发和生存率影响；在D5微小肿瘤模型中，D5 ALDHhigh CSC-DC疫苗对少量肿瘤细胞引发肿瘤的抑制作用。
　　方法：免疫功能正常的C3H小鼠皮下注射0.5×106 SCC7细胞建立外科手术联合治疗模型，在接种肿瘤细胞后第21天，除无手术组的小鼠，手术切除其余小鼠的皮下肿瘤，第22天、29天和36天对这些小鼠进行PBS、未分选的SCC7细胞致敏的树突状细胞疫苗（H-DC疫苗）、SCC7 ALDHlow肿瘤细胞致敏的树突状细胞疫苗（ALDHlow-DC疫苗）和ALDHhigh CSC-DC疫苗皮下注射治疗，观察原位肿瘤的复发、大小及小鼠的生存率。免疫功能正常的B6小鼠，皮下注射5000个D5细胞建立微小肿瘤模型，24h后分别进行PBS、H-DC、ALDHlow-DC和ALDHhigh CSC-DC疫苗治疗，并在肿瘤接种后的第8天重复治疗一次，比较各组之间小鼠的生存率及肿瘤大小。在ALDHhigh CSC-DC和anti-PD-L1联合治疗模型中，第22天和29天进行两次疫苗治疗；在第22、25、29和32天进行anti-PD-L1抗体(0.05mg/小鼠/次)腹腔注射，观察肿瘤复发及小鼠的生存时间。
　　结果：在SCC7外科手术联合治疗模型中，在第40天，无手术组的小鼠均因肿瘤的过度生长到达处死标准而处死。PBS组小鼠在第30天即出现肿瘤复发，所有该组小鼠生存期不超过55天。与无手术切除组和 PBS组的小鼠比较，H-DC和ALDHlow-DC疫苗明显延迟了肿瘤的术后复发，延长了小鼠的生存时间。但是与H-DC和ALDHlow-DC疫苗相比，ALDHhigh-DC疫苗能够更好的减少肿瘤的复发，更加显著地延长小鼠的生存时间。在D5微小肿瘤模型中，PBS、H-DC、ALDHlow-DC疫苗的治疗并不能有效的抑制肿瘤的形成和生长，3组之间肿瘤的生长和小鼠的生存时间并无显著差异。但是与PBS、H-DC、和ALDHlow-DC组比较，ALDHhigh-DC疫苗能够非常有效的抑制肿瘤的生长，延长小鼠生存时间。并且SCC7小鼠皮下肿瘤切除后，与其它单独的疫苗治疗相比，anti-PD-L1抗体联合SCC7 ALDHhigh CSC-DC疫苗治疗可以更好的抑制肿瘤复发，延长小鼠的生存时间。
　　结论：在 SCC7外科手术联合治疗模型中，在小鼠原位肿瘤切除后，SCC7 ALDHhigh-DC疫苗有效的抑制肿瘤的原位复发，延长小鼠的生存期。在D5微小肿瘤模型中，D5 ALDHhigh-DC疫苗有效的抑制肿瘤的生长，延长肿瘤负载小鼠的生存时间。并且在SCC7外科手术模型中皮下肿瘤手术切除后，腹腔注射anti-PD-L1抗体可以显著增强 SCC7 ALDHhigh CSC-DC疫苗的抑瘤效果。
　　第二部分： ALDHhigh CSC-DC疫苗抑制肿瘤肺转移的相关研究
　　目的：黑色素瘤D5细胞具有很强的转移能力。基于前期D5微小肿瘤模型的实验基础，继续研究H-DC、ALDHlow-DC和ALDHhigh-DC疫苗对肿瘤肺转移的作用，对肿瘤细胞上PDL1表达量的影响，以及细胞因子CCL27、CCL28及相关受体CCR10在肿瘤远处转移中所发挥的作用。
　　方法：在D5微小肿瘤模型实验结束时，收集各组小鼠的肺组织，肺固定液固定，计算肺转移的情况。随机收取各组小鼠一部分肺组织，苏木精伊红染色，在组织病理水平观察肺部转移情况。各组小鼠的肿瘤组织消化为单个细胞悬液，检测ALDHhigh和ALDHlow肿瘤细胞上PD-L1的表达水平。将各组小鼠肺组织消化成单个细胞，逆转录定量PCR（qRT-PCR）检测细胞因子CCL27和CCL28的表达水平，流式细胞术检测CCR10在各组小鼠的未分选肿瘤细胞、ALDHhigh和 ALDHlow肿瘤细胞上的表达，并比较各组之间的差异。将CCR10 siRNA沉默的D5细胞或者未处理的D5细胞置于transwell的上室，不同浓度的细胞因子CCL27和CCL28置于下室，细胞因子趋化实验比较D5细胞的迁移能力。
　　结果：ALDHhigh-DC疫苗比PBS、H-DC和 ALDHlow-DC疫苗更加有效的抑制了肿瘤的肺部转移，P值均小于0.05。经过 ALDHhigh-DC疫苗治疗的11只小鼠中，只有2只小鼠发生了肺转移；PBS组、ALDHlow-DC组和 H-DC组的11只小鼠中，分别有9只、9只和8只小鼠发生了肺转移。肺组织切片显示PBS、H-DC和 ALDHlow-DC组小鼠肺组织中均有大块肿瘤转移灶, ALDHhigh-DC组小鼠肺组织中未见。流式图显示ALDHhigh-DC疫苗显著降低ALDHhigh和ALDHlow肿瘤细胞上PD-L1的表达水平，特别是ALDHhigh肿瘤细胞上的表达。qRT-PCR检测细胞因子CCL27和CCL28在各组小鼠肺组织中的表达水平，结果显示相对于其它3组而言，ALDHhigh-DC组小鼠肺组织 CCL27和CCL28的mRNA的水平明显降低。流式细胞术检测各组小鼠肿瘤细胞上CCR10的表达，结果显示相比较于PBS组、H-DC组和 ALDHlow-DC组，ALDHhigh-DC组小鼠未分选肿瘤细胞上的CCR10表达水平明显降低；CCR10在ALDHhigh肿瘤细胞上的表达量明显高于ALDHlow肿瘤细胞上的表达量；并且ALDHhigh-DC疫苗的治疗同时显著降低CCR10在 ALDHhigh和 ALDHlow肿瘤细胞上的表达，特别是ALDHhigh肿瘤细胞。细胞因子趋化实验结果显示细胞因子CCL27和CCL28的浓度在一定范围内增加会增强其对D5细胞的趋化能力；CCR10 siRNA处理后的D5细胞CCR10的表达受到明显的抑制；相比较于未处理的D5细胞，CCR10 siRNA处理后的D5细胞向细胞因子CCL27和CCL28的迁移能力显著降低。
　　结论：D5微小肿瘤模型中，ALDHhigh CSC-DC疫苗能够显著抑制小鼠的肺转移；并且降低肿瘤细胞上PD-L1的表达水平，特别是ALDHhigh肿瘤细胞上的表达；同时能够降低肺组织中CCL27和CCL28的mRNA水平；明显下调CCR10在肿瘤细胞上的表达，特别是在ALDHhighCSCs上的表达。CCR10 siRNA沉默后的D5细胞向细胞因子CCL27和CCL28的迁移能力显著下降。
　　第三部分 ALDHhigh CSC-DC疫苗抗肿瘤免疫机制的研究
　　目的:在前期D5微小肿瘤模型的实验基础上进一步研究ALDHhigh CSC-DC疫苗所诱导的机体抗肿瘤免疫反应，包括体液免疫和细胞免疫，证明 ALDHhigh CSC-DC疫苗能够诱导或增强靶向CSCs的免疫反应。
　　方法：D5微小肿瘤模型实验结束后，收集各组小鼠的脾脏淋巴细胞，体外用IL-2（300IU/ml）、抗-CD40抗体（5μg/ml）和LPS（5μg/ml）活化B细胞，ELISA检测B细胞培养上清中IgG的含量。将各组含有等量IgG的B细胞培养上清分别与D5 ALDHlow或ALDHhigh肿瘤细胞共同孵育做抗体结合实验，流式细胞术检测不同的疫苗体内诱导的抗体的特异性。在补体存在的情况下，将各组小鼠B细胞的培养上清和D5 ALDHhigh或 ALDHlow肿瘤细胞共同孵育，检测补体依赖性细胞毒作用（CDC）。CD3免疫磁珠纯化脾脏的T淋巴细胞，抗-CD3（2μg/ml）和抗-CD28(2μg/ml)抗体活化，IL-2(300IU/ml)增殖，体外活化产生细胞毒性T细胞（CTL）。以CTL为效应细胞，D5 ALDHhigh或 ALDHlow肿瘤细胞为靶细胞，检测CTL对ALDHlow细胞和ALDHhigh细胞的杀伤能力。收集各组小鼠的肿瘤组织，消化为单个肿瘤细胞，用ALDEFLUOR试剂染色，流式检测ALDHhigh肿瘤细胞在各组小鼠肿瘤中所占的比例。
　　结果：D5微小肿瘤模型中，各组的脾淋巴细胞经过抗-CD40抗体和LPS体外活化后，B细胞的纯度在90％以上。抗体结合实验显示ALDHhigh-DC组小鼠活化后的B细胞培养上清高特异性地结合D5 ALDHhigh肿瘤细胞，远远高于PBS组、H-DC组和ALDHlow-DC组；但是H-DC组和 ALDHlow-DC组小鼠B细胞的培养上清高特异性结合D5 ALDHlow非肿瘤干细胞。CDC实验结果显示ALDHhigh CSC-DC疫苗致敏的B细胞的培养上清特异性裂解ALDHhigh CSCs，裂解能力显著高于其它3组。但是靶细胞是ALDHlow非肿瘤干细胞时，ALDHlow-DC和 H-DC组的B细胞培养上清具有最显著的杀伤能力，ALDHhigh CSC-DC组的B细胞培养上清具有很弱的杀伤能力。在不同效应细胞与靶细胞比例的情况下，D5 ALDHhigh-DC疫苗致敏的CTL对D5 ALDHhigh CSCs均具有显著的特异性杀伤作用，明显高于其它3组，具有显著统计学意义。相反，ALDHlow-DC和H-DC治疗组的CTL选择性地杀伤D5 ALDHlow非肿瘤干细胞。流式图显示ALDHhigh-DC组小鼠肿瘤组织中只有1.7%ALDHhigh CSCs存留；但是PBS、H-DC和 ALDHlow-DC组小鼠的肿瘤组织中ALDHhigh CSCs所占的比例依次分别为13.4%、7.5%和8.3%。与PBS、ALDHlow-DC和 H-DC治疗组相比，D5 ALDHhigh-DC疫苗显著减少了肿瘤组织中 ALDHhigh CSCs的数量，P值均小于0.005。
　　结论：在D5微小肿瘤模型中，ALDHhigh CSC-DC疫苗可以通过增强机体的体液免疫和细胞免疫靶向杀伤CSCs,减少CSCs在肿瘤中的比例。

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前言

参考文献

第一部分：ALDHhigh CSC-DC疫苗抗肿瘤免疫作用的体内研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分:ALDHhigh CSC-DC疫苗抑制肿瘤肺转移的相关研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 ALDHhigh CSC-DC疫苗抗肿瘤免疫机制的研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述： 靶向肿瘤干细胞的研究进展

附录 博士期间发表论文

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