microRNA-155在肿瘤进展过程中对髓源抑制性细胞和树突状细胞的调控作用研究

摘要

第一部分：microRNA-155对髓源抑制性细胞的调节作用研究
　　目的：通过在野生型(wild type，WT)和bic/miR-155基因敲除（miR-155-/-）小鼠体内建立黑色素瘤（B16-F10）和肺癌（Lewis lung carcinoma，LLC）模型以及通过体外模拟肿瘤微环境，比较miR-155表达水平对荷瘤小鼠髓源抑制性细胞功能和行为的影响，并揭示其潜在的分子机制。
　　方法：分别应用 WT和 microRNA-155(miR-155)全身以及骨髓细胞特异性敲除（通过骨髓移植建立）的小鼠建立黑色素瘤和肺癌模型，比较肿瘤在不同小鼠体内的生长情况以及免疫细胞成分的差异；应用细胞分选技术分离纯化荷瘤小鼠的髓源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）并比较miR-155缺失对其主要功能分子如 Arg-1（arginase-1）和 iNOS(inducible nitric oxide synthetase)表达的影响；应用trans-well技术比较miR-155缺失对MDSCs迁移的影响；将MDSCs与T淋巴细胞共培养研究miR-155表达水平对MDSCs免疫抑制能力影响；分别从WT和miR-155-/-小鼠获取肿瘤组织后，用免疫组织化学染色的方法测定肿瘤组织内的血管内皮细胞CD31的表达，以此表示肿瘤内血管新生能力，同时检测 WT和 miR-155-/- MDSCs中促血管生成因子如 MMP2（matrix metalloproteinase2）、MMP9以及 VEGF(vascular endothelial growth factor)的表达。
　　结果：在bic/miR-155基因敲除小鼠体内，两种实体肿瘤的生长速度明显快于WT对照组，同时伴随MDSCs在肿瘤微环境中的募集增加。进一步的骨髓移植实验证明骨髓细胞特异性 miR-155缺失能够复制系统性miR-155敲除引起的促肿瘤生长表型。体外实验显示肿瘤浸润的miR-155-/- MDSCs高表达多种与其迁移有关的趋化因子，且较 WT MDSCs有更强的迁移能力。除此之外，我们还发现miR-155的靶分子，HIF-1α（hypoxia induced factor-1α)，在 miR-155缺失的MDSCs表达增高，通过调节趋化因子 CXCL1，CXCL3和 CXCL8的表达来促进MDSCs向肿瘤微环境迁移。此外，在本课题中，我们还发现miR-155-/-MDSCs有更强的免疫抑制能力和促进血管新生的能力。
　　结论：在本课题中，我们分别应用了 B16-F10黑色素瘤和 LLC肺癌模型，首次揭示了 miR-155的缺失能通过增加 MDSCs向肿瘤微环境的募集来促进肿瘤进展。另外，miR-155缺失的MDSC具有更强的免疫抑制功能和促进血管新生的功能。以上发现提示我们可以运用慢病毒、脂质体或者纳米粒等载体使 MDSCs中miR-155的表达增高来弱化免疫抑制反应、增强免疫细胞的抗肿瘤效应，从而全面提高抗肿瘤免疫治疗的效果。
　　第二部分：microRNA-155在肿瘤进展中对树突状细胞的调节作用研究
　　目的：通过在WT和miR-155-/-小鼠体内建立原位乳腺癌模型、体外模拟肿瘤微环境以及通过慢病毒感染途径获得 miR-155高表达的细胞，比较 miR-155表达水平对小鼠树突状细胞成熟、迁移能力以及功能的影响，揭示其潜在的分子机制、探索以miR-155高表达DC（dendritic cell，树突状细胞）为基础的肿瘤免疫治疗的转化价值。
　　方法：分别在WT和miR-155-/-小鼠体内建立原位乳腺癌模型，比较肿瘤在两组小鼠体内的生长情况以及免疫细胞成分的差异；应用流式细胞术比较miR-155缺失对DC成熟状态的影响；将DC与T淋巴细胞共培养研究miR-155缺失的DC功能的影响；将 DC接种于荷瘤小鼠腹股沟区皮下，运用流式细胞术检测不同的DC向肿瘤引流淋巴结的迁移能力；体外实验应用肿瘤细胞条件培养基和肿瘤裂解物刺激BMDCs(bone marrow derived dendritic cells，骨髓来源的树突状细胞)，来研究可溶性免疫抑制因子如IL-6和 IL-10对DC功能的影响；分别应用WT、miR-155-/-和miR-155高表达的BMDCs作为肿瘤治疗性疫苗。比较miR-155表达水平对以DC为基础的肿瘤免疫治疗效果的影响。
　　结果：我们的研究结果显示在乳腺癌中，miR-155在调控 DC多重功能过程中起着十分重要的作用：DC miR-155表达水平与其成熟程度、迁移能力、细胞因子产生能力以及激活 T淋巴细胞的能力密切相关。我们也进一步揭示了 miR-155通过表观遗传学水平修饰CCR7表达来调控DC的迁移。此外，我们也发现在肿瘤微环境中广泛存在的两种细胞因子——IL-6和 IL-10，能够通过下调 DC miR-155的表达，从而使DC处于相对不成熟的状态而无法行使正常的功能。在两种小鼠乳腺癌模型（EO771/C57BL/6和4T1/Balb/c）中，我们分别证实了miR-155缺失明显减低然而 miR-155高表达能够显著增强 DC治疗性疫苗的疗效。
　　结论： miR-155对DC的功能有着多重调节作用，通过单一上调DC miR-155的表达可以显著提高针对乳腺癌的DC治疗性疫苗的疗效。

目录

声明

第一部分microRNA-155对髓源抑制性细胞的调节作用研究

绪论

材料和方法

结果分析

讨论

参考文献

第二部分microRNA-155 在肿瘤进展中对树突状细胞的调节作用研究

绪论

材料和方法

结果分析

讨论

参 考 文 献

综述：microRNA-155对免疫细胞的调控作用

附表1.英文缩略词简表

附表2. RT-PCR引物序列表

附表3. 抗体列表

攻读博士学位期间完成的学术论文

致谢