HMGB-1在石英致炎性反应及纤维化中的作用

摘要

结晶游离二氧化硅俗称石英，是组成地壳岩石的主要成分，常见于矿山、采石、冶金、原材料生产等多种职业环境中。石英粉尘是工业界危害较大的职业有害因素，长期吸入石英粉尘不仅引起矽肺（职业病），还引发慢性阻塞性肺病、肺结核和自身免疫疾病等多种疾病。矽肺是一种由于长期吸入石英粉尘而形成的以肺纤维化为特征的全身性疾病。石英粉尘引起矽肺发生的具体机制至今仍不十分清楚，很多国内外学者曾提出多种机制假说，尚难以完全解释石英引起肺纤维化病理的一些过程。既往研究表明，石英粉尘被吸入肺部终末细支气管和肺泡区域后，巨噬细胞吞噬和排除部分石英颗粒，一方面，巨噬细胞Nalp3炎性小体被激活，释放炎症因子、趋化因子等引起肺部炎性反应；另一方面，石英颗粒直接毒作用于细胞膜，使其破损，释放胞内炎性因子和颗粒物，再次吸引更多的巨噬细胞吞噬和成纤维细胞聚集，分泌纤维，此过程周而复始，使得机体长期处于慢性炎性状态，最终导致纤维化的形成。
　　高迁移率族蛋白家族（High Mobility Group Box Protein,HMGB）是一类非组蛋白染色体蛋白质。由HMGB-1、HMGB-2、HMGB-3三个成员构成，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有很高的迁移率而得名。研究显示，Nalp3炎性小体激活后刺激白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）释放，IL-1β可以诱导HMGB-1从细胞核转移至细胞质。破损坏死的细胞将HMGB-1释放在胞外。胞外的HMGB-1可以与其他靶细胞的表面受体如糖基化终产物受体（Receptor for advanced glycation end products,RAGE）、Toll样受体结合，激活NF-κB通路，进一步刺激肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）、白介素6（Interleukin-6,IL-6）和IL-1β等前炎性因子的大量释放，导致炎性的延续发生。因此我们假设，石英粉尘吸入后，激活巨噬细胞Nalp3炎性小体，产生Caspase-1，裂解pro-IL-1β等炎性因子前体，促使大量的炎性因子IL-1β成熟产生，诱导HMGB-1由细胞核内转移至细胞质。当巨噬细胞破裂时，胞内HMGB-1被释放，与靶细胞受体RAGE、Toll受体等结合，激活下游NF-κB通路，进一步刺激更多炎性因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的产生，该循环通路维持肺部炎性反应，最终形成肺纤维化。
　　本课题拟通过动物实验，测定石英粉尘染尘后，小鼠HMGB-1表达水平变化，观察HMGB-1与靶细胞表面受体结合后，对下游通路相关炎性因子表达水平及纤维化程度的影响；并通过中和HMCB-1，观察缓解炎性反应和纤维化的作用。最后在矽肺病例对照人群中进行相关蛋白因子的验证。本研究分为三部分：（1）小鼠气管滴注石英粉尘悬液，观察HMGB-1的表达水平和HMGB-1中和抗体的抑制效果。（2）HMGB-1及其受体在石英粉尘导致小鼠肺组织损伤、炎性反应和纤维化过程中的作用。（3）在人群矽肺-健康对照人群中，研究矽肺患者和健康对照外周血中HMGB-1及其相关受体的表达水平，及其与矽肺患病的关系等。
　　第一部分 石英染尘后小鼠肺部HMGB-1的表达水平及其中和抗体效果评价
　　目的：建立石英染尘小鼠模型，测定HMGB-1表达，确定染尘剂量和观察时间点，探索HMGB-1中和抗体的使用剂量和效果。
　　方法：采用石英粉尘悬液气管滴注的方法制造小鼠急性炎性反应模型，将120只C57BL/6雄性小鼠随机分为4组，每组30只。4组小鼠分别为：生理盐水对照组：滴入等体积的生理盐水；石英粉尘组：气管滴注石英粉尘悬液；石英+HMGB-1中和抗体组：气管滴注用HMGB-1中和抗体配制的石英粉尘悬液；石英+rmHMGB-1组：气管滴注加有重组HMGB-1蛋白配制的石英粉尘悬液。分别于单次染尘后6h、1d、2d、3d、7d随机处死6只小鼠。收集小鼠肺部灌洗液，采用酶联免疫吸附试验法（ELISA）方法检测小鼠肺部灌洗液中HMGB-1的表达水平。
　　结果：在单次染尘后1d、2d、3d时，与生理盐水对照组相比，染尘三组（石英组、HMGB-1中和抗体组和HMGB-1重组蛋白）小鼠肺部灌洗液中HMGB-1表达水平明显升高，且差异具有统计学意义（P<0.05）；与石英组相比，HMGB-1中和抗体组表达水平降低（P<0.05），重组蛋白组小鼠表达水平明显升高（P<0.05）。染尘组在不同观察点比较，染尘后2d，肺部灌洗液中HMGB-1表达水平最高，染尘后第7d，染尘各组小鼠肺部灌洗液表达水平仍高于生理盐水组，但相较于染尘后1、2、3d组，各组HMGB-1表达水平有所下降。
　　结论：单次性气管滴注石英粉尘悬液可使小鼠肺部灌洗液中HMGB-1表达水平明显增加；HMGB-1中和抗体可有效抑制肺部灌洗液中HMGB-1的表达水平。染尘后第7d，各染尘组小鼠肺部灌洗液中HMGB-1表达水平有所回落。结果提示单次染尘HMGB-1持续的观察时间不应超过7d。
　　第二部分 HMGB-1在石英粉尘致小鼠肺部损伤、炎性反应及纤维化中的作用
　　目的：Ⅰ.探讨HMGB-1在石英粉尘致小鼠肺部损伤中的作用；Ⅱ.探讨HMGB-1在石英致小鼠肺组织炎性反应中的作用；Ⅲ.探讨HMGB-1在石英致小鼠肺组织纤维化中的作用。
　　方法：将192只C57BL/6雄性小鼠随机分为6组，每组32只，石英粉尘悬液气管滴注染尘。6组小鼠分别为：空白对照组、生理盐水组、石英粉尘组、石英+IgY组（非特异性抗体组）、石英+HMGB-1中和抗体组、石英+rmHMGB-1组。分别于染尘后2d、7d、28d、84d处死8只小鼠。其中28d组与84d组小鼠，每隔7d染尘一次。采用微量酶标法检测肺部灌洗液中总蛋白（TP）含量、乳酸脱氢酶（LDH）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）活性；对肺部灌洗液中的炎性细胞进行分类计数；采用ELISA方法检测肺部灌洗液中IL-6、HMGB-1、TNF-α的表达水平；实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测肺组织中IL-6、IL-1β、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、TNF-α、转化生长因子-β(TGF-β)、胶原Ⅰ型蛋白（COL1A1）、胶原Ⅲ型蛋白（COL3A1）、纤维连接蛋白（Fibronectin）、TLR4的mRNA的相对表达水平；H&E、Masson、天狼星红染色后观察肺组织炎性及纤维化程度。
　　结果：Ⅰ.石英染尘对呼吸道细胞的损伤及HMGB-1的作用:与空白对照和生理盐水组相比，染尘四组（石英、石英+IgY、石英+HMGB-1中和抗体、石英+rmHMGB-1）肺部灌洗液中TP含量及LDH、ACP、AKP活性明显增加。与石英染尘组相比，HMGB-1中和抗体组小鼠肺部灌洗液中TP含量、LDH、ACP、AKP活性在染尘后2d有所降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。随后的三个时间点（7d、28d、84d），中和HMGB-1未减轻肺灌洗液中上述蛋白或酶水平。
　　Ⅱ.HMGB-1对石英所致炎性反应的作用:H&E染色结果显示，与空白对照和生理盐水组相比，各染尘组小鼠均出现较为明显的炎性浸润及肉芽肿性炎。与单纯石英染尘组相比，HMGB-1中和抗体组小鼠肺组织炎症病变有所改善，HMGB-1重组蛋白可加重小鼠肺部炎性反应；与对照组相比，染尘四组小鼠肺部灌洗液细胞总数、中性粒细胞及巨噬细胞数明显增加；与单纯石英染尘组相比，各时间点中，在HMGB-1重组蛋白组中细胞总数、巨噬细胞及中性粒细胞数明显升高，HMGB-1中和抗体可降低其水平，且差异具有统计学意义（P<0.05）；与空白对照和生理盐水组相比，染尘四组小鼠肺组织的IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-α的mRNA的相对表达水平明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05）；染尘组小鼠肺部灌洗液中HMGB-1、IL-6、TNF-α表达水平明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。与单纯石英染尘组相比，在HMGB-1重组蛋白组中，肺部灌洗液中HMGB-1、IL-6、TNF-α表达水平以及IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-αmRNA相对表达水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。HMGB-1中和抗体后IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-αmRNA相对表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）；小鼠肺泡灌洗液HMGB-1、IL-6、TNF-α表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　Ⅲ.HMGB-1对石英染尘肺纤维化作用：与对照组相比，Masson染色结果显示，在28d、84d组中，各染尘组小鼠均出现不同程度的胶原纤维沉积和小面积纤维团块。与石英染尘组相比，HMGB-1中和抗体组小鼠上述病变明显减轻；天狼猩红染色结果，在石英染尘后84d出现较为明显的胶原纤维沉积，与单纯石英染尘比较，HMGB-1中和抗体组镜下胶原蛋白面积有所减少，差异有统计学意义（P<0.05）。在28d、84d，与对照组相比，染尘四组小鼠肺组织TGF-β、COL1A1、COL3A1、Fibronectin、TLR4mRNA表达水平明显增加，与单纯石英染尘组相比，其表达水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。HMGB-1阻断后上述蛋白基因表达水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　结论:石英染尘引起小鼠肺组织损伤，HMGB-1中和抗体未明显减轻其损伤程度；HMGB-1重组蛋白可加重小鼠肺组织炎性反应及纤维化程度，HMGB-1中和抗体可有效的减轻小鼠肺部肺组织炎性反应及纤维化程度。
　　第三部分 HMGB-1及其受体在矽肺患者血浆中的表达水平及其关联性分析
　　目的：通过病例-对照研究，测定外周血HMGB-1及其受体水平及分布，分析HMGB-1的表达水平与矽肺患病关联性。
　　方法：本研究纳入矽肺患者133人，匹配同年龄的健康工人125人，研究人群均为男性。采集研究人群基本信息及具体职业史，ELISA方法检测研究人群血浆中HMGB-1、TGF-β1、COL1A1、COL3A1、MMP-2、MMP-9含量；RT-PCR方法检测外周血中TLR2、TLR4、RAGE的mRNA表达水平；采用多元logistic回归分析HMGB-1及其受体与矽肺患病及患病进展之间的关系；ROC曲线分析HMGB-1筛查矽肺患病的指标的检验效能。
　　结果：与健康对照相比，矽肺患者外周血HMGB-1表达水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。HMGB-1的主要受体TLR2、TLR4、RAGE的mRNA相对表达水平也较健康人群显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。在矽肺患者中，HMGB-1的表达水平与TLR2、TLR4的mRNA表达水平呈正相关（r=0.26,P=0.02；r=0.25,P=0.01）；同时，logistic回归分析结果显示，HMGB-1表达升高可增加患矽肺危险度（OR=1.68，95％CI:1.37-2.06)。此外，研究结果显示，随着矽肺期别上升，外周血HMGB-1表达水平及TLR4的mRNA的相对表达水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。通过ROC分析可知，HMGB-1作为生物标志物诊断矽肺患病的ROC曲线下面积为0.84，灵敏度为83.00%，特异度为77.50%。
　　结论：与健康对照相比，矽肺患者血浆中HMGB-1表达水平明显增加，并且其主要受体TLR2、TLR4、RAGE的mRNA相对表达水平也明显升高；HMGB-1的高表达与矽肺患病危险性之间存在关联；HMGB-1可能作为一种生物标志物诊断矽肺患病。

目录

声明

缩写词及中英文对照

前言

技术路线图一：小鼠实验技术路线

技术路线图二：健康-矽肺人群研究技术路线

第一部分 石英染尘后小鼠肺部HMGB-1的表达水平及其中和抗体效果评价

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

第二部分 HMGB-1在石英粉尘致小鼠肺部损伤、炎性反应及纤维化中的作用

第一小节 HMGB-1在石英致肺组织损伤中的作用

第二小节 HMGB-1在石英致小鼠肺部炎性反应中的作用

第三小节 HMGB-1在石英粉尘所致小鼠肺部纤维化病变中的作用

第三部分 HMGB-1及其主要受体在矽肺患者外周血的表达水平及作用研究

第一小节HMGB-1及其受体在矽肺患者血浆中的表达水平及其关联性分析

第二小节 HMGB-1及其受体与矽肺分期之间的关联性研究

参考文献

结论

本研究创新之处

本研究不足之处

综述：高迁移率族蛋白B1致器官纤维化的作用及机制研究进展

研究生期间工作总结

致谢