脊髓四氢生物喋呤在慢性束缚应激致痛觉过敏形成中的作用及机制

摘要

目的：探讨脊髓四氢生物喋呤在慢性束缚应激致大鼠痛觉过敏中的分子机制。
　　方法：⑴雄性SD大鼠28只，体重190～220 g，随机分为两组：对照组（Con）、慢性束缚应激组（RS）。应激模型于每天早上9：00开始，下午3：00结束，应激期间大鼠禁食禁饮，模型持续7天。于模型建立前一天，模型建立第3天，第5天，第7天采用Von Frey丝检测大鼠机械性缩爪阈值（PWMT），热辐射仪器检测大鼠热缩爪阈值（PWTL）及热水浴法检测大鼠甩尾潜伏期（TFL）。模型建立第7天测痛完成后立马断头取脊髓腰膨大组织，采用Western Blot及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法检测脊髓组织中GCH1， iNOS, nNOS及eNOS蛋白水平和mRNA水平的表达；硝酸还原酶法检测脊髓NO水平，高效液相色谱分析（HPLC）检测血浆和脊髓组织中BH4的含量，并采用Mass Array系统进行GCH1基因甲基化水平的检测。⑵雄性SD大鼠51只，体重190～220g，均鞘内置管，恢复7天取成功置管的大鼠随机分为5组：溶剂对照组（Vehicle+RS），BH4治疗组（BH4+RS），DAHP治疗组（DAHP+RS），L-Name治疗组（L-Name+RS）以及L-Name、BH4联合治疗组（L-Name+BH4+ RS）。鞘内注射于应激开始前15分钟进行，L-Name、BH4联合治疗组L-Name先于BH430分钟鞘内注射，持续7天。于模型建立前1天，模型建立第3天，第5天，第7天检测PWMT，PWTL以及TFL。模型建立第7天测痛完成后取脊髓腰膨大组织，采用Western Blot，qRT–PCR的方法检测Vehicle+RS组，BH4+RS组及DAHP+RS组大鼠脊髓iNOS, nNOS及eNOS蛋白水平及mRNA水平的表达；采用硝酸还原酶法检测Vehicle+RS组，BH4+RS组，L-Name+RS组，L-Name+BH4+RS组及DAHP+RS组大鼠脊髓NO的改变。⑶雄性SD大鼠32只，体重190～220 g，均鞘内置管，恢复7天后取成功置管的大鼠随机分为3组：溶剂对照组（Vehicle+RS），7-NI治疗组（7-NI+RS），1400W治疗组（1400W+RS）。所有药物均于应激开始前15分钟进行鞘内注射，持续7天。于模型建立前1天，模型建立第3天，第5天，第7天检测PWMT，PWTL以及TFL。模型建立第7天测痛完成后取大鼠脊髓腰膨大组织，采用硝酸还原酶法检测三组大鼠脊髓NO的改变。
　　结果：①与对照组（Con）相比，慢性束缚应激组（RS）大鼠的PWMT，PWTL以及TFL均显著下降（P<0.05）；组内比较，慢性束缚应激组（RS）大鼠的PWMT，PWTL以及TFL呈时间依赖性的下降（P<0.05），对照组（Con）PWMT，PWTL及TFL无明显改变。Western Blot及qRT–PCR结果显示，RS组脊髓iNOS mRNA及蛋白水平于应激第7天明显上调（P<0.05），而nNOS和eNOS mRNA及蛋白水平应激前后无明显改变（P>0.05）；RS组大鼠脊髓NO含量及血BH4和脊髓BH4含量均明显增加（P<0.05）；GCH1甲基化结果显示应激组大鼠在CPG14，15（27909945，27909939）及CPG39（27909657）三个CpG岛呈低甲基化表达。②与溶剂对照组（Vehicle+RS）相比，BH4治疗组（BH4+RS）大鼠的PWMT，PWTL以及TFL显著下降（P<0.05），DAHP治疗组（DAHP+RS），L-Name治疗组（L-Name+RS）及L-Name、BH4联合治疗组（L-Name+BH4+RS）大鼠PWMT，PWTL以及TFL显著升高（P<0.05）；组内比较，BH4治疗组（BH4+RS），DAHP治疗组（DAHP+RS），L-Name治疗组及L-Name、BH4联合治疗组（L-Name+BH4+RS）痛阈呈时间依赖性的改变，并于模型建立第7天达到最高值或最低值。Western Blot及qRT–PCR结果显示，模型建立7天后，BH4治疗组（BH4+RS）大鼠脊髓iNOS的表达显著上调（P<0.05），DAHP治疗组（DAHP+RS）大鼠脊髓iNOS的表达显著下调(P<0.05)，而nNOS及eNOS的表达三组之间无明显改变（P>0.05）。硝酸还原酶法检测NO的结果显示BH4治疗组（BH4+RS）脊髓NO水平较溶剂对照组（Vehicle+RS）轻度增加（P>0.05），DAHP治疗组（DAHP+RS），L-Name治疗组（L-Name+RS）及L-Name、BH4联合治疗组（L-Name+BH4+RS）脊髓NO水平显著下降。③与溶剂对照组（Vehicle+RS）相比，7-NI治疗组（7-NI+RS）及1400W治疗组（1400W+ RS）大鼠的PWMT，PWTL以及TFL显著增加（P<0.05），并呈时间依赖性改变。硝酸还原酶法检测NO的结果显示，1400W治疗组（1400W+RS）脊髓NO水平较溶剂对照组（Vehicle+RS）显著下降（P<0.05），而7-NI治疗组（7-NI+RS）脊髓NO水平无明显改变（P>0.05）。
　　结论：慢性应激导致的GCH1甲基化程度降低可上调GCH1表达，诱导BH4合成增加；iNOS-NO级联系统可能是BH4调控作用中的重要下游机制。

目录

声明

缩略词表

前言

材料与方法

一、实验动物

二、主要仪器设备、试剂及溶液

三、试验方法

实验结果

1、BH4参与调控慢性束缚应激诱发的SIH的发生和发展。

2.脊髓NO介导BH4在慢性束缚应激大鼠痛觉过敏中的作用。

3．iNOS参与慢性束缚应激大鼠BH4诱发的痛觉过敏的调控。

讨论

结论

综述：应激诱导致痛觉过敏的研究进展

致谢