抗hKv1.3-E314肽段单克隆抗体的制备和鉴定

摘要

目的：为研制hKv1.3（human voltage-gated channel，人电压门控性钾离子通道）特异性阻滞剂，以hKv1.3胞外环肽段E314为抗原，制备针对hKv1.3胞外环肽段E314的特异性抗体，并对抗体进行纯化和鉴定。
　　方法：为制备抗hKv1.3特异性抗体，我们以hKv1.3胞外环肽段为抗原，制备特异性抗hKv1.3鼠单克隆抗体。根据氨基酸的抗原性、亲水性及柔韧性等特性，筛选出hKv1.3胞外环肽段E3处的含14个氨基酸的多肽段，作为抗原决定簇，合成多肽，并将其命名为E314。将E314与KLH相偶联，合成免疫原E314-KLH；将E314-KLH与佐剂完全乳化后，免疫小鼠。测定其血清的抗体效价；选择血清抗体效价最高的小鼠，进行免疫冲击。将该小鼠的脾脏，制成脾细胞悬液；在PEG的作用下，与骨髓瘤细胞进行融合。用HAT培养基，培养融合细胞；采用ELISA法，对细胞上清，进行抗体效价测定。选取抗体效价高的阳性细胞株，进行培养；并对其分泌的抗体，进行亚类鉴定。根据实验需要，选择能稳定分泌IgG单抗的阳性细胞株，进行克隆化培养。并通过动物体内诱生法，大量制备单抗；再用盐析法和Protein G亲和层析法，对单抗进行纯化。对抗hKv1.3胞外环肽段E314的单克隆抗体，测定其亲和力常数、效价及纯度。
　　结果：成功地合成了高纯度的hKv1.3通道蛋白胞外段E314。得到10株能分泌IgG单抗的阳性细胞株，其亚型为：#15、#19为G2a亚型；#7、11、14为G2b亚型；其余#1、#2、#3、#12、#17为G1亚型。根据后续研究需要，选取#14、#15号细胞株用于大量制备抗体。将抗体纯化后，测定#15株和#14株单克隆抗体的亲和常数，分别为：7.09×109L/mol和9.81×109L/mol，均属于高亲和力抗体。纯化后的单抗蛋白浓度分别为2.2mg/ml和1.37mg/ml；且证实，#14、#15号抗hKv1.3-E314肽段单抗，均具有较高的纯度。
　　结论：成功地制备出抗hKv1.3-E314肽段单克隆抗体，为下一步探究hKv1.3通道蛋白及抗hKv1.3单克隆抗体的功能与作用提供了有效途径。

目录

主要英文缩略词表

前言

1.Kv1.3与T淋巴细胞、自身免疫性疾病：

2.Kv1.3与其他疾病：

参考文献

材料与试剂

1.实验主要仪器设备

2.实验对象：

3.实验试剂与材料：

方法

1.免疫小鼠：

2.制备杂交瘤细胞：

3.单克隆抗体的大量制备及纯化：

4.单克隆抗体的特异性检测：

结果

1.抗原设计与合成：

2.小鼠免疫后的血清效价：

3.筛选杂交瘤细胞：

4.单克隆抗体的亚类鉴定：

5 .抗h Kv1.3小鼠单克隆抗体亲和常数的测定：

6.测定抗hKv1.3单克隆抗体的纯度：

讨论

参考文献

综述:急性冠状动脉综合征口服抗血小板药物治疗进展

致谢