肝糖原分子结构的分布均匀性及昼夜节律变化和1型糖尿病小鼠肝糖原分子结构研究

摘要

糖原是高度支化的葡萄糖聚合物，是动物体内糖的贮存形式，广泛存在于多个器官和组织。其中，肝糖原在维持体内血糖平衡中有重要意义。糖原有三级结构：葡萄糖单元通过α-(1→4)键连接形成直链，各直链之间通过α-(1→6)键连接形成高支化的β粒子（直径约20nm），而β粒子可以进一步连接形成更大的α粒子（直径100-300nm），其在电镜下呈西兰花样外观。
　　糖原的结构中包含了许多和代谢相关的信息，且糖原的结构与其性质关系密切，如高度支化的分子结构能保证糖原良好的水溶性；肌肉糖原中只存在β粒子可以保证快速降解功能。实验室前期工作已证实db/db糖尿病小鼠肝糖原的稳定性比健康小鼠肝糖原差，在DMSO处理后直径较大的α粒子更容易降解为直径较小的β粒子，而β粒子因具有更大的比表面积，其降解的速度高于α粒子，因此db/db小鼠糖原的这一不稳定性可能导致血糖不受控而促进糖尿病发病。因此，研究糖原的结构对于了解糖原的性质、代谢以及理解糖尿病的发病机制有重要意义，并期望在研究中能为寻找新的药物靶点提供理论依据和实验基础。
　　为了进一步的研究肝糖原结构和糖尿病的关系，本论文分三个部分:
　　第一部分:主要研究来自于肝的不同部位的糖原的分子结构的差异。此前糖原结构的研究中多使用小鼠为实验动物模型，因小鼠肝脏较小、糖原总量较少不利于提取，故多使用整个肝脏提取糖原进行研究；但当使用其他肝脏较大的动物（或者人）进行研究时，不便将整个肝脏取出进行糖原提取，而多使用某一块组织进行检测。而有研究表明肝脏不同叶在代谢上有区别，这些区别可能导致糖原结构上差异，因此有必要对糖原结构在肝脏内的均匀性进行研究。一方面，该研究可以确认此前使用整个肝脏提取糖原进行研究时得到的数据是否具有代表性，另一方面可以为后续使用较大动物模型进行糖原结构研究时采用何种方法进行实验提供指导意义。本研究使用Wistar大鼠为模型，使用了在不同时间点（包括上午10点以及下午2点）处死的大鼠，将大鼠肝脏分为6叶分别提取糖原。以水相体积排阻色谱（size exclusion chromatography，SEC）以及荧光辅助的毛细管电泳（fluorescence assisted capillary electrophoresis，FACE），透射电镜（transmission electron microscope，TEM）为主要研究手段，研究来自不同肝叶的糖原的重量分布（weight distribution）、链长分布（chain length distribution,CLD）以及形态差别。实验结果表明，在不同时间点，大鼠肝脏的不同叶的糖原的重量分布以及链长分布存在均一性，糖原形态十分相似。此实验结果表明，进行糖原结构分析时，从肝的不同位置提取的糖原均具有代表性，这意味着肝脏活检样品可用于糖原结构的研究。
　　第二部分:主要研究健康小鼠和糖尿病小鼠肝糖原结构的昼夜节律性变化。研究肝糖原结构随昼夜节律可以更好的理解糖原的代谢过程。实验室的前期研究发现小鼠肝糖原结构随昼夜节律有显著变化，并提出了符合实验结果的假说。但该研究使用的DMSO相SEC对α粒子和β粒子的分离度不好，DMSO对糖原结构有影响，有必要使用分离度更好的SEC方法获得更准确的数据。此外，该研究仅使用了正常小鼠，未对糖尿病小鼠肝糖原结构的昼夜节律变化进行研究。因此本研究使用分离α粒子和β粒子效率更高的水相SEC为主要研究手段，同时研究了健康小鼠和糖尿病小鼠在不同时间点内糖原结构的差异，包括糖原的重量分布以及糖原的稳定性。实验结果表明，在所有时间点的健康小鼠和db/db小鼠糖原均主要由α粒子构成。对于健康小鼠糖原，来自糖原降解相的糖原比来自糖原合成相的糖原更稳定，且具有相对更低的密度。而来自于不同时间点的所有db/db小鼠的肝糖原稳定性均较差。根据此实验结果提出了两种符合实验结果的假说：1.健康小鼠的糖原在刚合成的时候是不稳定的，而在随后的降解过程中逐渐变稳定，这有利于控制血糖水平。而在db/db小鼠中，这种糖原加固的过程受损。2.存在有两种糖原：一种紧密但是不稳定，另一种松散但稳定。在糖原降解时优先降解不稳定的糖原，稳定的糖原降解更慢以优化血糖的控制。这一研究结果对于理解糖原代谢有重要意义；而下一步实验可深入研究健康小鼠和db/db小鼠在不同时间各糖原相关蛋白的表达，这将有助于理解造成糖原稳定性差异的原因，这对寻找新的药物靶点或有一定的启发。
　　第三部分:主要研究健康和1型糖尿病模型的结构差异。前期研究已经证实db/db糖尿病小鼠肝糖原相比健康小鼠肝糖原稳定性较差，而1型糖尿病相比2型糖尿病有不同的发病机制，其发病机制为免疫介导的胰岛损伤导致胰岛素分泌的绝对不足，而2型糖尿病则伴随胰岛素抵抗。有必要对1型糖尿病模型的的肝糖原结构进行研究以更好的理解糖尿病和糖原结构之间的关系。本研究以水相SEC为主要研究手段，使用两种不同的1型糖尿病动物模型，包括1型糖尿病自发型小鼠模型（Non-obese diabetic mice,NOD mice）和链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病小鼠模型，考察了其肝糖原与对应的健康小鼠肝糖原的结构差异。实验结果显示，1型糖尿病小鼠糖原对DMSO的处理不稳定，而对应的健康小鼠在糖原降解相的糖原较为稳定，这与此前与2型糖尿病小鼠（db/db小鼠）的糖原结构研究结果类似。这种糖原的不稳定性可能是导致高血糖的原因，根据实验结果推测糖原结构的稳定性与胰岛素分泌相对或绝对性不足有关。
　　本论文使用优化后的分析方法从三个不同的方面对前期研究成果进行扩展，研究肝糖原结构在肝脏内的均匀性有助于了解如何获得具有普遍代表性的糖原结构数据，实验结果表明从肝的不同位置提取的糖原均具有代表性，这意味着肝脏活检样品可用于糖原结构的研究；研究健康和糖尿病小鼠肝糖原结构的昼夜节律变化有助于理解糖原的代谢，以及进一步了解健康和糖尿病小鼠在糖原代谢上的区别，实验结果表明对于健康小鼠糖原，来自糖原降解相的糖原比来自糖原合成相的糖原更稳定。而来自于不同时间点的所有db/db小鼠的肝糖原稳定性均较差。通过进一步的对影响糖原稳定性的因素进行研究可以为寻找新的潜在药物靶点提供依据；研究两种1型糖尿病小鼠糖原结构可以进一步了解糖原结构和糖尿病的关系，实验结果显示1型糖尿病小鼠糖原对DMSO的处理不稳定，而对应的健康小鼠在糖原降解相的糖原较为稳定。这种糖原的不稳定性可能是导致高血糖的原因，根据实验结果推测糖原结构的稳定性与胰岛素分泌相对或绝对性不足有关。

目录

声明

英文缩略词(Abbreviation)

前言

第一章 大鼠肝脏不同叶糖原分子结构的研究

实验材料与方法

实验结果和讨论

结论

第二章 肝糖原结构随时间节律的变化

实验材料与方法

实验结果和讨论

结论

第三章 1型糖尿病小鼠糖原结构的研究

实验材料与方法

实验结果和讨论

结论

全文总结

参考文献

综述：1糖原结构及其研究方法和糖尿病动物模型的研究进展

第一章 糖原结构和其研究方法

第二章 糖尿病实验动物模型

结语

参考文献

致谢

附录