纳米硒和铂-硒纳米材料模拟氧化酶特性及纳米硒抗动脉粥样硬化活性的研究

摘要

硒(Se)是人体必需的一种微量营养元素，其在维持机体的氧化还原平衡稳态以及在癌症、心血管疾病等的防治中起着重要的作用。但传统硒化合物存在着营养剂量和毒性剂量之间的界限较窄以及生物利用率较低的问题，限制了其在临床疾病防治方面的应用。纳米硒(SeNPs)作为一种高效低毒的单质硒形态，其在体外和体内实验中展现出了优良的抗氧化和抗肿瘤等生物活性，但是仍然缺乏从分子角度对其优良生物性能的合理阐述。尤其是硒原子作为含硒酶的活性位点，缺乏从模拟酶角度来认识SeNPs的高生物活性和低毒性。另外，动脉粥样硬化(AS)性心血管疾病已成人类健康重大威胁。已有研究显示SeNPs有抗氧化、降血糖、降血脂等多重生物效应，而氧化应激、高血糖、高血脂正是导致AS的危险因素，提示SeNPs可能有抗AS活性，但是目前未见相关报道。
　　本文首先探讨了SeNPs是否具有模拟酶活性。其次，将Se作为铂(Pt)纳米催化剂的掺杂原子形成Pt-Se纳米复合材料，探讨了纳米Se和Pt模拟氧化酶活性的协同作用以及在毒性金属离子Hg2+检测方面的应用。最后，研究了SeNPs对载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠AS病变及肝损伤的影响及机理。主要结果如下：
　　以还原型谷胱甘肽和牛血清白蛋白作为还原剂和保护剂，化学还原亚硒酸钠制备了无定形的SeNPs。SeNPs尺寸分布较均一(25-70nm)，平均粒径大约为38.7nm。SeNPs能够催化底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)被溶解氧氧化成蓝色产物，具有一定的模拟氧化酶特性。SeNPs模拟氧化酶的最适反应条件为pH4和30°C，并且其模拟酶活性表现出了对SeNPs浓度和粒径大小的依赖性。SeNPs模拟氧化酶的米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)分别为0.0083mol/L和3.042?M·min-1。溶解氧在其模拟氧化酶催化过程中起到了电子受体的作用。SeNPs模拟酶催化的机理可能是：硒自身对氧化态物质的吸附能力以及纳米材料尺寸效应，加速了电子对在电子供体TMB和电子受体氧气之间的传递。
　　Pt基双组分纳米材料展现出了相较于单组份Pt纳米颗粒更为优异的催化活性和稳定性。本文利用湿化学还原法制备了Pt和Pt-Se纳米颗粒，表征结果显示Pt-Se纳米颗粒由Pt/Se按照原子摩尔比7:3组成，粒径大约为13.5nm；而Pt纳米颗粒由纯元素Pt组成，粒径大约为5.4nm。通过催化底物TMB被溶解氧氧化的反应考察了Pt和Pt-Se纳米颗粒的模拟氧化酶活性，结果显示Pt-Se纳米颗粒的最适反应条件为pH4.4和40°C，Pt纳米颗粒的最适反应条件为pH3.8和30°C。两者模拟氧化酶的动力学参数显示，相较于Pt纳米颗粒，Pt-Se纳米颗粒对底物TMB具有更低的米氏常数(Km)和更高的催化常数(Kcat)，证明了Pt-Se纳米颗粒具有更强的底物吸附作用和模拟氧化酶活性。Pt-Se纳米颗粒增强的模拟酶活性归因于Se掺杂形成的协同效应，Se掺杂一方面能够提供更多的催化活性位点，另一方面杂原子Se的锚定作用增强了Pt对氧化产物的耐受性。Pt-Se纳米颗粒的模拟酶活性能被Hg2+明显的抑制，基于这种现象，利用Pt-Se纳米颗粒建立了一种检测Hg2+离子的比色方法。该方法显示了高敏感性和选择性，结果在0-2.5μM范围内呈现线性并且检测下限达到了70nM。
　　以ApoE-/-小鼠为实验性AS病变模型，探讨了SeNPs抑制AS的功效以及可能的机制。32只8周龄ApoE-/-小鼠随机分为AS模型组、他汀组、SeNPs组以及联合用药组，并采用高脂饲料喂养。灌胃方式进行药物干预，方案如下：他汀组(阿托伐他汀10mg/kg/d)，SeNPs组(SeNPs50μg/kg/d)，联合用药组(阿托伐他汀10mg/kg/d+SeNPs50μg/kg/d)，AS模型组给予等剂量生理盐水，灌胃8周后停止药物干预实验。检测小鼠血脂水平并对主动脉、心脏以及肾脏等组织进行病理切片研究。检测血清中氧化应激相关指标包括谷胱甘肽过氧化物酶活性(GPx)和超氧化物歧化酶活性(SOD)活性、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)水平。测定肝脏和肾脏的硒含量以及肝脏中相关抗氧化硒酶/硒蛋白基因表达。结果显示，与AS模型组相比，SeNPs能够显著降低血清总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量，减轻主动脉、心脏以及肾脏等组织病变。SeNPs能够明显升高血清中GPx和SOD活性，降低MDA水平并明显提升NO水平。SeNPs能够升高肝脏和肾脏中硒含量并上调体内抗氧化硒酶/硒蛋白基因表达。这些结果表明SeNPs能够明显降低血脂水平，抑制ApoE-/-小鼠AS病变。其可能通过上调抗氧化硒酶/硒蛋白表达，增强抗氧化活性，降低机体氧化应激水平来发挥抗AS机制。SeNPs和阿托伐他汀联合使用没有起到抑制AS的协同作用。
　　通过对ApoE-/-小鼠肝脏病变进行探讨，考察SeNPs对AS病症中肝损伤的影响及可能机制。检测肝脏TC、TG水平并对肝脏进行病理切片研究。检测肝脏还原型谷胱甘肽(GSH)浓度、GPx和过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶活性和促炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)α基因表达水平。并且对肝脏胆固醇合成代谢相关基因表达水平进行了探讨。结果显示，与AS模型组相比，SeNPs能够降低肝脏TC和TG水平，明显增强肝脏中GPx、CAT活性以及抗氧化剂GSH的水平，下调肝脏中TNFαmRNA表达水平。而且，SeNPs能够调控肝脏内胆固醇合成代谢相关基因表达水平，维持肝脏和机体内胆固醇水平的平衡。这些结果说明SeNPs不仅能抑制脂质过度累积造成的初始肝损伤，还能抑制氧化应激过剩和炎症反应对肝脏的二次损伤。但是，他汀和SeNPs联合用药造成了肝脏TG水平的升高，胆固醇反馈调节机制的破坏，加剧了ApoE-/-小鼠肝脏损伤。

目录

声明

1 绪论

1.1 引言

1.2 硒的生物化学及其与疾病的关系

1.3 SeNPs的简介及其研究进展

1.4 纳米材料模拟酶研究进展

1.5 本文选题思路以及主要研究内容

参考文献

2 SeNPs的制备及其模拟氧化酶的研究

2.1引言

2.2材料与方法

2.3结果

2.4讨论

2.5本章小结

参考文献

3 Pt-Se纳米颗粒增强氧化酶活性及其用于Hg2+检测

3.1引言

3.2材料与方法

3.3结果

3.4 讨论

3.5本章小结

参考文献

4 SeNPs对ApoE-/-小鼠AS病变的影响及抗氧化机理

4.1引言

4.2材料与方法

4.3结果

4.4 讨论

4.5 本章小结

参考文献

5 SeNPs对ApoE-/-小鼠肝损伤的影响及机理

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果

5.4 讨论

5.5 本章小结

参考文献

全文总结

致谢

附录Ⅰ 攻读博士学位期间完成的主要论文

附录Ⅱ 主要缩写词表（按字母顺序）