EGR1调控的颗粒细胞凋亡在卵巢衰老中的作用及其机制研究

摘要

背景与目的：
　　卵巢衰老是女性的卵巢功能随年龄增长而逐渐衰退的过程，受自然、遗传、基因、环境、免疫和人工等多因素影响，并且影响全身多个器官，其生殖功能衰老导致的女性生育力下降和内分泌功能衰老引起的雌激素分泌减少及由此导致的相关疾病如围绝经期症状、骨质疏松、泌尿生殖道萎缩症状及心血管疾病等对广大女性的身心健康造成了极大的伤害。卵泡闭锁是导致卵巢内卵泡和卵子丢失的主要过程，而后者是卵巢衰老的根本原因。颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的主要细胞学机制。通过探讨卵巢衰老过程中早期生长反应因子1（EGR1）在卵巢中的表达规律，通过体外实验验证其对颗粒细胞增殖和凋亡的调控作用并对其作用机制进行探讨。
　　方法：
　　（1）通过实时定量PCR方法和Western blot方法确定EGR1在年轻与年老小鼠卵巢中及卵巢衰老加速模型与CR卵巢衰老延缓模型小鼠卵巢中的表达差异；通过免疫组化检测方法确定EGR1在卵巢及各级卵泡中的表达定位。
　　（2）通过在体外小鼠的原代颗粒细胞中转染过表达质粒将 EGR1表达上调，通过实时定量PCR和Western blot方法检测颗粒细胞中EGR1的过表达效应，通过EdU方法检测 EGR1表达上调后对颗粒细胞增殖能力的影响，通过流式细胞仪结合AnnexinV/PI染色法和Hoechst染色法检测EGR1表达上调后对颗粒细胞凋亡的影响，通过实时定量PCR和Western blot方法检测EGR1表达上调后对颗粒细胞中增殖相关基因和蛋白的影响，通过Western blot方法检测EGR1表达上调后对凋亡相关途径相关蛋白表达及活性的影响。
　　（3）通过Western blot方法检测EGR1表达上调后对颗粒细胞及年老小鼠卵巢中凋亡相关通路分子的影响。
　　结果：
　　（1）EGR1mRNA和蛋白在年老小鼠卵巢中的表达明显升高，EGR1蛋白在卵巢衰老加速模型小鼠卵巢中的表达明显高于对照组，在CR卵巢衰老延缓模型小鼠的卵巢中表达明显低于正常对照组；EGR1蛋白在不同阶段卵泡的卵母细胞中均表达，但无明显差异，未检测到EGR1在卵泡膜间质细胞中和始基卵泡的颗粒细胞中表达；EGR1在颗粒细胞中的表达水平随着卵泡的生长和卵泡闭锁而增加，在闭锁卵泡中表达最强。
　　（2）体外颗粒细胞中EGR1的表达上调后，导致颗粒细胞增殖能力下降及增殖相关基因的改变；导致颗粒细胞凋亡数量增加，且随着时间的延长效应更加明显，并加重了ROS刺激对颗粒细胞诱发的凋亡反应；EGR1表达上调后诱导了颗粒细胞的线粒体凋亡途径相关蛋白的表达变化。
　　（3）体外颗粒细胞中EGR1的表达上调后，增强了P53蛋白的磷酸化，增强了NF-κB蛋白的磷酸化；年老小鼠卵巢中NF-κB的磷酸化水平也是增加的。
　　结论：
　　（1）EGR1与卵巢衰老相关，在卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡中发挥重要的调控作用。
　　（2）EGR1表达上调后导致颗粒细胞增殖减少，凋亡增加，诱导凋亡效应随时间延长和有害刺激的加入更明显，EGR1通过线粒体途径促进颗粒细胞凋亡。
　　（3）EGR1可能通过增强P53的磷酸化抑制颗粒细胞的增殖，通过活化NF-κB信号通路促进颗粒细胞凋亡，从而促进卵泡闭锁的发生。
　　总结，我们的研究认为年龄相关的EGR1上调通过调控P53的活性抑制颗粒细胞的增殖，通过激活NF-κB通路促进颗粒细胞的凋亡，并且对ROS等有害刺激因素对卵巢的损伤有放大作用，从而促进卵泡闭锁的发生，调控卵巢衰老的进程。

目录

声明

华中科技大学博士学位论文创新点概述

前言

第一部分 EGR1在小鼠卵巢衰老和卵泡发育过程中的表达

引言

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

参考文献

第二部分 EGR1对体外颗粒细胞功能的影响

前言

1. 材料和方法

2. 结果

3. 讨论

参考文献

第三部分 EGR1在颗粒细胞凋亡中的作用机制探讨

前言

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

参考文献

综述：卵巢衰老的基因治疗研究进展

附录一：英文缩写词表

附录二：攻读博士学位期间发表的论文以及参与的课题

致谢