miR-146a在卵巢早衰中对卵巢颗粒细胞凋亡调控的机制研究

摘要

目的：探讨卵巢早衰患者(POF)血浆及卵巢颗粒细胞中miR-146a的水平变化及其对卵巢颗粒细胞凋亡的影响及可能的机制研究.rn 方法：收集6例卵巢早衰(POF)患者血浆,2份正常卵巢功能女性血浆,1例正常卵巢颗粒细胞和2例原代分离的POF卵巢颗粒细胞.实验利用Real-timePCR的方法检测收集的血浆及卵巢颗粒细胞中miR-146a的表达变化,利用生物信息学的方法预测miR-146a的靶基因,并利用双荧光素酶基因检测miR-146a与IRAK1、IRAK6在卵巢颗粒细胞中的直接靶向关系.为了检测miR-146a对卵巢颗粒细胞凋亡的影响及可能机制,实验合成pre-miR-146a和anti-miR-146a,并转染卵巢颗粒细胞.转染成功后利用Real-time PCR的方法检测miR-146a、IRAK1和TRAF6mRNA水平变化.然后再利用流式细胞仪和Tunel试剂盒检测被转染的卵巢颗粒细胞的凋亡情况,并利用Western Blot的方法检测被转染的卵巢颗粒细胞IRAK1、TRAF6、NFκB-p65、p-NFκB-p65、IκBα、p-IκBα表达情况变化及凋亡相关因子caspse8、caspase9、cleaved caspase3、cleaved PARP 的表达变化.最后向被转染的卵巢颗粒细胞培养液中加入caspase8抑制剂Z-LEHID-FMK和caspase9抑制剂Z-IEHD-FMK,利用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,并用Western Blot检测细胞凋亡相关因子cleaved caspase3、cleaved PARP的表达变化.rn 结果：卵巢早衰患者血浆及卵巢颗粒细胞中miR-146a的表达情况及miR-146a与IRAK1、TRAF6的靶向作用关系: 实验采用QPCR的方法检测了2份正常卵巢功能女性血浆,6例卵巢早衰(POF)患者血浆,1例正常卵巢颗粒细胞和2例原代分离的POF卵巢颗粒细胞中miR-146a的表达变化.结果发现,POF患者血浆及卵巢颗粒细胞中miR-146a的表达与正常卵巢功能女性血浆及卵巢颗粒细胞中miR-146a的表达相比均明显升高,差异具有统计学意义(P＜0.05).利用生物信息学的软件预测miR-146a的靶基因为IRAK1和TRAF6.双萤光素酶实验结果显示在共转染IRAK 1-3'UTR-psi-CHECK2重组质粒和miR-146a mimics的细胞样本中,荧光素酶活性强度相比其它组显著下调(P＜0.05),并且在共转染TRAF6-3'UTR-psi-CHECK2重组质粒和miR-146amimies的细胞样本中,荧光素酶活性强度相比其它组显著下调(P＜0.05).pre-miR-146a和anti-miR-146a转染卵巢颗粒细胞后相关因子的表达变化及细胞凋亡情况:实验针对miR-146a分别合成pre-miR-146a和anti-miR-146a,并转染分离的正常的卵巢颗粒细胞.QPCR的结果显示转染pre-miR-146a的卵巢颗粒细胞miR-146a的表达与对照组相比明显上调,而转染anti-miR-146a的卵巢颗粒细胞miR-146a的表达与对照组相比明显下降,差异均具有统计学意义(P＜0.05).并且转染pre-miR-146a的卵巢颗粒细胞IRAK1、TRAF6 mRNA的水平与对照组相比均明显下降(P＜0.05),而转染anti-miR-146a的卵巢颗粒细胞IRAK1、TRAF6 mRNA的水平与对照组相比显著升高(P＜0.05).Western Blot结果显示各组卵巢颗粒细胞中NFκB-p65和IκBα的表达没有明显的变化,但是在转染pre-miR-146a的卵巢颗粒细胞中p-NFκB-p65和p-Iκ则明显下调(P＜0.05),而在转染anti-miR-146a的卵巢颗粒细胞中的表达明显升高(P＜0.05).同时还发现相关的细胞凋亡因子caspase8、caspase9、cleaved caspase3、cleaved PARP在转染pre-miR-146a的卵巢颗粒细胞中表达均明显上调(P＜0.05).流式双染的结果发现卵巢颗粒细胞转染pre-miR-146a后,与对照组相比凋亡率明显上调(P＜0.05),而转染anti-miR-146a的卵巢颗粒细胞凋亡率则下降(P＜0.05).Tunel结果得出相同的结论.caspase抑制剂对转染miR-146a后的卵巢颗粒细胞凋亡影响:卵巢颗粒细胞转染miR-146a后,再向细胞培养液中分别加入caspase8抑制剂Z-LEHD-FMK和easpase9抑制剂Z-IEHD-FMK,流式双染的结果显示卵巢颗粒细胞转染pre-miR-146a后,其凋亡率显著增加.但是加入easpase8抑制剂Z-LEHD-FMK和caspase9抑制剂Z-IETD-FMK后其凋亡百分比又明显下降,差异具有显著性(P＜0.05).并且Western Blot的结果显示加入caspase的抑制剂后培养的卵巢颗粒细胞Cleaved caspase3和Cleaved PARP的蛋白含量均比对照组低(P＜0.05).rn 结论：miR-146a在卵巢早衰患者的血浆和卵巢颗粒细胞中表达均上调,并且miR-146a表达上调能抑制IRAK1、TRAF6的转录,减少IRAK1、TRAF6蛋白质的含量,IRAK1、TRAF6蛋白量的减少又对NF-kB活性产生抑制作用,进而促进颗粒细胞的凋亡.提示miR-146a在卵巢早衰患者颗粒细胞凋亡中起了重要的促进作用,其机制可能为miR-146a的表达升高抑制IRAK1、TRAF6的转录和NF-kB的活性.本研究为临床上抑制卵巢早衰患者颗粒细胞凋亡的药物开发提供了一定的理论依据.