β-胡萝卜素高产菌三孢布拉霉的选育及发酵工艺研究

摘要

β-胡萝卜素是一类重要的类胡萝卜素，在医药领域、食品领域和化妆品领域等方面具有广泛应用。β-胡萝卜具有顺式和全反式两种异构体，研究表明，顺式异构体的β-胡萝卜素具有更高营养价值和抗心血管疾病等功能，该异构体主要来源于天然β胡萝卜素，而非人工合成。利用三孢布拉霉菌株发酵是生产天然β-胡萝卜素的主要途径之一，但仍存在产量不高、菌种稳定性较差等关键问题。因此，选育三孢布拉霉稳定高产β-胡萝卜素菌株成为研究重点。为此，本研究以实验室保藏的三孢布拉霉（Blakeslea trispora）为出发菌株，通过建立丝状真菌分离单菌落方法以及高产β-胡萝卜素的三孢布拉霉菌株高通量筛选方法，并结合三孢布拉霉诱变选育技术，以期选育获得高产菌株，并通过发酵工艺优化，提高β-胡萝卜素产量，取得的主要研究结果如下：
　　（1）建立了一种丝状真菌分离单菌落方法，可有效解决丝状真菌平板分纯筛选难题。本研究获得一种丝状真菌筛选剂烯草酮，在烯草酮与PDA固体培养基体积比为0.01％-0.04%时，可使三孢布拉霉形成明显单菌落，更好的防止菌株退化，保证菌株性能的稳定性且该三孢布拉霉单菌落发酵β-胡萝卜素性能也得到明显提高，而烯草酮浓度进一步提高则会抑制菌丝生长。本技术在产油脂丝状真菌被孢霉(Mortierella)、模式真菌构巢曲霉(Aspergillus nidulans)也可以很好的推广应用。
　　（2）建立了三孢布拉霉高通量筛选方法，并成功选育获得β-胡萝卜素高产突变株。首先，建立了利用OD值快速检测孢子数量的方法，以及利用洛伐他汀定向筛选三孢布拉霉的方法，通过理化诱变筛选获得高产孢能力的负菌，使其产孢量较出发菌株提高了4.87倍；其次，结合TTC染色，确定了96深孔板高通量筛选高产β-胡萝卜素突变株的最佳条件：即，在三孢布拉霉发酵时间2天后，用1.2%TTC染色8h，二甲基亚砜振荡萃取1.5h，萃取液在酶标仪上485nm下检测菌体TTC染色程度，根据β-胡萝卜素产量与TTC染色程度成正比筛选，利用上述筛选技术，获得β-胡萝卜素高产突变菌株Blakeslea trispora XL2（-），β-胡萝卜素产量最高为1.34±0.06g/L，相对于原始出发菌株Blakeslea trispora（-）提高了121.9倍。对菌株Blakeslea trispora XL2（-）连续6次传代进行遗传稳定性评价，结果表明，Blakeslea trispora XL2（-）可稳定遗传。实时荧光定量分析了β-胡萝卜素代谢途径中的5个关键酶基因表达，发现突变株XL2中carG，carB和carRA显著提高，强化了β-胡萝卜素的代谢流，提高了β-胡萝卜素的产量。
　　（3）优化了β-胡萝卜素发酵条件。首先，确定了单因素优化的发酵条件：装液量50mL/250mL，三孢布拉霉突变株XL2（-）和正菌先接入种子培养基培养再混合发酵；其次，通过响应面分析，优化了发酵培养基（g/L）：大豆油20，玉米浆干粉13.96，磷酸二氢钾3.17，玉米粉40，葡萄糖10，黄豆粉30，硫酸镁1，Span202，BHT4，VB10.0001。最后，采用上述优化条件，使β-胡萝卜素产量显著提高，最高达1.41±0.09g/L，较出发菌株Blakeslea trispora（-）提高了128.2倍。
　　以上研究大幅提高了三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素的水平，为其产业化应用奠定了较好的基础。

目录

声明

1 绪论

1.1 β-胡萝卜素简介

1.2 β-胡萝卜素来源

1.3 三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素的研究进展

1.4 三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素过程中存在的问题

1.5 本课题主要意义及研究内容

2 丝状真菌分离单菌落方法研究

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

3 基于高通量筛选技术选育高产β-胡萝卜素菌株

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

4 三孢布拉霉高产β-胡萝卜素发酵工艺优化研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

5 总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

致谢

参考文献

附录I 攻读硕士期间成果

附录II 主要英文缩写词表