矿化小肠粘膜下层脱细胞基质/煅烧骨多孔复合材料诱导骨再生实验研究

摘要

本文主要从以下几部分进行论述： 第一部分：仿生矿化小肠粘膜下层脱细胞基质对骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化影响研究 目的：探讨小肠粘膜下脱细胞基质作为矿化模板的可能性，以及矿化小肠粘膜下层脱细胞基质对骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响。 方法：采用多步骤法提取猪小肠粘膜下层脱细胞基质(Small intestinal submucosa,SIS)，利用HE组织学及电子扫描显微镜观察SIS组织学结构及脱细胞程度。将SIS浸泡于1.5倍的模拟体液中进行仿生矿化，利用扫描显微镜SEM、X射线衍射分析XRD对0、7、14天不同时间点的矿化效果进行观察分析。选取最佳矿化效果的SIS进行细胞实验研究。将SD大鼠骨髓间充干细胞rBMSC接种在SIS、SIS(mSIS)上培养一段时间进行MTT增殖、Calcein-AM/PI死活染色及碱性磷酸酶活力检测实验，以确认矿化修饰之后的SIS是否能够提供细胞黏附、增殖及成骨分化的成骨微环境。 结果：采用多步骤提取的SIS从HE染色及SEM扫描结果显示，SIS主要由交叉的胶原纤维网络组成，脱细胞程度较为彻底，无明显细胞成分残留。对SIS进行不同矿化处理时间，矿化效果不同，在14天矿化处理效果最佳。选取14天矿化SIS进行细胞研究，结果表明矿化处理SIS细胞增殖MTT值、活细胞密度及碱性磷酸酶活力显著性地高于未矿化SIS。 结论：1.多步骤提取的SIS脱细胞程度较为完全，细胞相容性良好；2.SIS在1.5倍模拟体液中矿化效果最佳；3.矿化修饰SIS可以提供良好的促进细胞黏附、增殖及成骨分化。 第二部分：矿化小肠粘膜下层脱细胞基质/煅烧骨多孔复合材料制备及其理化性质 目的：制备矿化小肠粘膜下层脱细胞基质/煅烧骨多孔复合材料(mSIS/TBC)，并用SEM观察其结构和形貌利用X射线衍射分析(XRD)、傅里叶红外光谱仪(FITR)以及X射线光电子能谱(XPS)进行材料表面化学结构进行定性分析。 方法：利用高温煅烧牛松质骨，去除免疫原性的有机成分，获得三维多孔的TBC陶瓷支架。将多步骤法提取的SIS在液氮中进行球磨粉碎，并配制1%SIS溶液。利用冷冻干燥方法将SIS溶液与TBC支架进行复合，然后用EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)进行交联固化，获得三维多孔支架SIS/TBC。利用1.5倍的模拟体液处理SIS/TBC进行仿生矿化修饰，获得矿化的SIS/TBC复合材料即mSIS/TBC。作为下一部分生物实验阳性对照组材料，将骨髓间充质干细胞接种于TBC,进行成骨诱导培养14天之后进行脱细胞处理，从而获得干细胞来源的细胞外基质(ECM)复合材料mdECM/TBC。利用电子扫描显微镜SEM观察形貌和结构，利用X射线衍射分析(XRD)、傅里叶红外光谱仪(FITR)以及X射线光电子能谱(XPS)进行材料表面化学结构进行定性分析。 结果：SEM图片显示煅烧骨TBC保留天然骨组织良好互通性的孔隙结构。单纯TBC表面由平坦、精密排列的多边形石晶体组成，XRD鉴定为羟基磷灰磷灰石HA晶体相组成。FITR、XPS可以鉴定SIS成功与TBC复合。SEM观察SIS/TBC表面覆盖一层纤维网状的基质，经过14天矿化之后可以观察到颗粒状的晶体沉积，表示仿生矿化成功。mdECM/TBC表面同样也能观察到矿化物质形成。 结论：矿化小肠粘膜下层脱细胞基质/煅烧骨多孔复合材料mSIS/TBC不仅保留了天然骨的良好互通性的孔隙结构，还有类似天然骨组织的矿化ECM细胞微环境界面；mSIS/TBC与干细胞来源的ECM复合材料mdECM/TBC拥有相似空隙结构和材料界面。 第三部分：矿化小肠粘膜下层脱细胞基质/煅烧骨多孔复合材料体外对大鼠骨髓间充干细胞成骨分化研究 目的：探讨矿化小肠粘膜下层脱细胞基质/煅烧骨多孔复合材料（mSIS/TBC）对大鼠骨髓间充质干细胞BMSC的增殖、死活、成骨分化等生物行为影响，并解释其诱导成骨分化的可能分子机制 方法：将第三代的SD大鼠BMSC接种在单纯TBC支架、mSIS/TBC支架以及mdECM/TBC支架上，置于常规培养基中培养。在培养1、3、5、7之后进行BrdU细胞增殖实验；第7和14天进行Calcein-AM/PI细胞死活双染检测。在培养7和14天进行碱性磷酸酶（ALP）染色及活力检测。在培养14和21天进行碱性磷酸酶（ALP）染色及活力检测茜素红(ARS)染色及定量分析；在培养7和14天之后，进行Real-Time PCR检测分析Runx2、Col-Ⅰα、Ocn、Opn、Bmp2、Vegf等基因表达水平；在TBC组、mSIS/TBC组细胞培养第7天之后，Westen blot分析Smad1/5/8、Erk1/2、P38、JNK信号通路关键分子蛋白表达水平。并在mSIS/TBC组给与相关通路关键分子抑制剂进行干预实验，检测效应蛋白RUNX2、OCN表达水平。 结果：BrdU细胞增殖结果显示，mSIS/TBC组的BrdU水平明显地高于单纯TBC的BrdU水平，并具有统计学意义（P<0.05）。Calcein-AM/PI结果显示，mSIS/TBC组的活细胞百分比略高于单纯TBC组，但是没有统计学意义（P＞0.05）；但是mSIS/TBC组的活细胞密度显著性地高于单纯TBC组，具有统计学意义（P＜0.05）。ALP染色及活力检测显示，mSIS/TBC对于单纯TBC显著促进了ALP活力水平。ARS染色结果显示，mSIS/TBC组相对于单纯TBC组茜素红染色更深，钙结节形成更多。ARS定量分析显示ARS染色差异具有统计学意义（P＜0.05）。PCR分析结果显示，mSIS/TBC组成骨相关基因Runx2、Col-Ⅰα、Ocn、Opn、Bmp2及成血管基因Vegf表达水平明显高于单纯TBC组,并具有统计学差异（P＜0.05）。Western blot结果显示，mSIS/TBC可能通过激活磷酸化的Smad1/5/8及磷酸化ERK1/2通路介导BMSC成骨分化。而对于mSIS/TBC、mdECM/TBC组间，BrdU水平、活细胞百分比、活细胞密度、ALP染色及活力、ARS染色以及成骨相关基因表达水平则并没有统计学差异（P＞0.05）。 结论：mSIS/TBC具有良好的细胞亲和力。相对于单纯TBC支架，mSIS/TBC显著性地促进BMSC增殖、成骨分化以及成血管基因表达。mSIS/TBC可以提供与mdECM/TBC支架相当的骨诱导能力。 第四部分：矿化小肠粘膜下层脱细胞基质/煅烧骨多孔复合材料修复大鼠临界性颅骨缺损实验研究 目的：通过大鼠临界性颅骨缺损模型，评估矿化小肠粘膜下层脱细胞基质/煅烧骨多孔复合材料体内修复骨缺损效果。 方法：按照植入材料的不同，随机将30只将实验动物平均分为三组：A组单纯煅烧骨TBC组；B组矿化小肠粘膜下层复合锻烧骨组；C组干细胞来源的矿化天然细胞外基质复合锻烧骨mdECM/TBC组。材料采用环氧乙烷消毒，将消毒好的支架植入两侧颅骨缺损。术后6、12周麻醉处死，取出颅骨样本进行Micro-CT扫描，基于Micro-CT内置统计分析软件分析新生骨体积所占百分数（Bone volume/Tissue volume，BV/TV%）。EDTA脱钙之后石蜡包埋切片并进行HE、Masson染色，利用Paranomic viewer系统摄取缺损区域全景图像。并利用ImagePro Plus软件进行新生骨面积、新生血管密度进行定量分析。 结果：Micro-CT三维重建图像显示：相对于移植单纯TBC组，移植mSIS/TBC、mdECM/TBC组有显著性新骨生成。BV/TV%结果分析显示，在6、12周，移植mSIS/TBC、mdECM/TBC组的BV/TV%显著性高于移植TBC组（P＜0.05）。但是在移植mSIS/TBC、mdECM/TBC两组组间的BV/TV%并没有显著性差异（P＞0.05）。通过HE全景图显示，术后6周TBC组主要以纤维结缔组织填充缺损区域，新生骨从缺损边缘开始长入。相对于TBC组，mSIS/TBC、mdECM/TBC观察到更多新生骨形成。在术后12周，HE染色高倍镜下观察到大量新生骨和新生血管填充在mSIS/TBC、mdECM/TBC材料的内部空隙当中，而对于单纯TBC组材料，仅仅由结缔组织填充。对缺损区域进行新生骨面积进行定量分析，结果显示mSIS/TBC、mdECM/TBC组在第6、12周新骨面积明显高于TBC对照组（P＜0.05），而mSIS/TBC、mdECM/TBC两组间比较，新生骨面积并没有显著性差异（P＞0.05）。 结论：mSIS/TBC相对于TBC显著性提升骨再生效果，这提示矿化小肠粘膜下层脱细胞基质mSIS赋予了煅烧牛松质骨TBC良好骨诱导能力。组织来源的ECM复合材料mSIS/TBC能够取得干细胞来源的ECM复合材料mdECM/TBC相当的骨再生效果。

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