胆碱酯酶中谷氨酸197/202的质子化状态研究

摘要

丁酰胆碱酯酶（butyrylcholinesterase，BChE）是人体中的一个重要酶，与许多疾病或者健康问题密切相关，也是阿尔兹海默症（Alzheimer's disease，AD）的重要靶标之一。AD因其患病人数众多且不断增长，给社会和家庭带来严峻的考验。目前批准用于缓解AD的药物主要是胆碱酯酶抑制剂（cholinesterase inhibitors，ChEIs）。他克林（tacrine）是最早引入临床用于治疗AD的一个ChEI，它既可以作用于乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE），也可以作用于BChE，是一个双重抑制剂。BChE和他克林的复合物晶体结构（PDB ID:4BDS）显示，在他克林旁边解析出了一个意料之外的甲酰基-脯氨酸分子，而他克林相关的各种实验中是不包含甲酰基-脯氨酸分子的。这引出一个重要问题：使用晶体结构中的结合模式来分析很多甲酰基-脯氨酸不存在的实验观测是否可靠？在本文中通过分子动力学模拟（Molecular Dynamics，MD）回答了上述问题，并且意外发现了Glu197的质子化状态与很多研究者认为的有所不同。深入分析了MD模拟的结果，发现与一个保守水相关的氢键网络在其中起到重要作用。在此基础上，还研究了BChE其他体系中Glu197的质子化以及AChE体系中Glu202的质子化状态。 第一章中，综述了课题研究背景以及研究中涉及到的理论基础与方法。 第二章中，研究了甲酰基-脯氨酸是否会对他克林在BChE中的结合模式造成影响。通过100ns的MD模拟，发现无论甲酰基-脯氨酸是否存在，以及无论甲酰基-脯氨酸采取何种质子化状态，都无法得到晶体结构中的结合模式。通过对结构的仔细分析，提出并验证了Glu197为质子化态的可能。这与很多既往的研究中认为的不同。在Glu197采取质子化态的模拟中，无论甲酰基-脯氨酸是否存在，或者以何种质子化状态存在，他克林的结合模式均与晶体结构中一致。这表明，尽管解析出了来源不明的甲酰基-脯氨酸分子，晶体结构4BDS仍然是可以用于分析不含甲酰基-脯氨酸分子的实验结果的。 第三章中，提出了氢键网络是Glu197的不同质子化状态对模拟结果造成影响的根本原因。通过对上一章节中提到的MD模拟进一步分析，发现一个关键且高度保守的水分子能够与多个残基包括质子化的Glu197作用，形成了一个重要的氢键网络。它位于催化三联体中His438的下方，阻止处于loop区的His438构象产生大的变化。而去质子化的Glu197则由于与保守水之间的排斥作用，不能参与进该氢键网络，最终导致该氢键网络的瓦解，进而导致催化三联体的解体。更进一步通过CpHMD（Constant pH MD）模拟表明，Glu197在该氢键网络中只能为质子化态。 第四章中，研究了apo BChE中Glu197的质子化状态。通过多个重复的MD模拟证明了在apo BChE中存在着相同的规律，即Glu197应该质子化，并且水的氢键网络在维持催化的His438的稳定性上非常重要。 第五章中，研究了sarin抑制的AChE与HI6复合物体系中Glu202（对应BChE中的Glu197）的质子化状态。这一体系有两个晶体结构，PDB ID分别为2WHP与5FPP，其中解析出的HI6构象有差异，而只有5FPP中的构象才是HI6重活化AChE的活性构象。在5FPP解析出来之前，没有成功模拟出5FPP中HI6的构象，目前也未发现有模拟出5FPP中HI6构象的相关报道。本章内容中，先通过CpHMD模拟证明Glu202应该质子化，其次通过比较Reduce确定的质子化状态与CpHMD确定的质子化状态的MD模拟，发现只有Glu202采取了正确的质子化状态才能模拟出5FPP中的活性构象。同时与BChE体系中相同，在AChE体系中氢键网络也起到稳定His438构象的作用。 值得注意的是，由于在溶液中谷氨酸pKa较低，在分析实验观测时，胆碱酯酶中的Glu197/Glu202很长时间内都被视为去质子化，其中有些解释不一致或者不清楚。我们的结果对于更好地解释这些问题提供了一个重要的线索。在以后针对胆碱酯酶分析实验观测、设计高活性抑制剂、研究催化反应机制等过程中，Glu197/Glu202的质子化状态应该被考虑到。

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