LncRNA CCAT1在食管鳞状细胞癌中的功能性研究

摘要

目的：利用生物信息学方法初步探讨lncRNA CCAT1在食管鳞状细胞癌（ESCC，esophageal squamous cell carcinoma）癌组织和正常组织的差异性表达，预测分析它与ESCC预后的联系。在组织和细胞水平上，运用生物学实验分析lncRNA CCAT1在ESCC中功能。同时初步探讨LncRNA CCAT1与原癌基因c-Myc之间的联系，研究其潜在的机制，进而为ESCC的早期诊断及治疗提供新的策略。 方法：检索LncRNADisease、Lncipedia和TANRIC三个数据库并综合分析lncRNA CCAT1与ESCC的关系。运用JASPAR数据库预测c-Myc能否识别lncRNA CCAT1启动子特定区域。在生物学实验中，我们运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR,quantitative real-time polymerase chain reaction）比较分析35例ESCC患者癌组织及癌旁组织中lncRNA CCAT1表达水平差异，同时按照年龄、性别、肿瘤分化程度、有无淋巴结转移和TNM分期等临床特征把患者分组，统计分析lncRNA CCAT1表达的差异性与临床特征的联系。在细胞水平上，比较正常食管上皮细胞系（HET-1A）及三株食管癌细胞系（EC109、KYSE-510、EC9706）中lncRNA CCAT1的表达水平。在细胞功能实验中，我们选取EC109和EC9706作为研究对象，通过脂质体lipo2000瞬时转染siRNA（si-CCAT1）使lncRNA CCAT1低表达，并转染相应的negative control（si-NC）作为阴性对照。通过细胞划痕试验评估低表达的CCAT1对细胞迁移能力的影响，通过Transwell侵袭试验评估低表达的CCAT1对细胞侵袭能力的影响，通过CCK-8实验评估低表达的CCAT1对细胞增殖能力的影响。在机制方面，我们将si-c-Myc和si-NC转染到ESCC细胞系中，运用qRT-PCR检测lncRNA CCAT1的表达水平，然后将si-CCAT1和si-NC转染到ESCC细胞系中，分别检测c-Myc mRNA转录和蛋白的表达水平，探寻lncRNA CCAT1与c-Myc之间的关系。 结果：利用生物信息学分析表明lncRNA CCAT1与ESCC可能存在一定联系，有进一步研究的潜能，同时预测得到c-Myc作为转录因子可以识别lncRNA CCAT1启动子区域的E-box元件（CACATG）。在生物学实验中，lncRNA CCAT1在ESCC癌组织中的表达水平显著高于正常食管癌旁组织（p＜0.05），并且其表达水平与淋巴结转移的情况和TNM分期高低密切相关，但在患者的年龄、性别和分化程度等临床特征分组中的表达差异无显著统计学意义。相比于正常食管鳞状上皮细胞系HET-1A，lncRNACCAT1在食管鳞癌细胞EC109、K510和EC9706三种细胞系中的表达也均有明显升高（p＜0.05）。细胞功能性研究发现，与si-NC对照组相比，使用si-CCAT1转染EC109和EC9706后，细胞的增殖、迁移和侵袭能力均被显著抑制（p＜0.05）。在EC109细胞和EC9706细胞中转染si-c-Myc的实验组，与转染si-NC阴性对照组对比发现，lncRNA CCAT1的表达水平显著下调。相同的方法，在EC109细胞和EC9706细胞中转染si-CCAT1后，与转染si-NC组对比发现，c-Myc mRNA转录水平显著降低，用Western blot测定c-Myc蛋白表达量也相应下调。 结论：LncRNA CCAT1在ESCC癌组织和细胞系中的表达水平均是上调的，并且与肿瘤的TNM分期和淋巴结转移情况有关。它可以通过增强细胞的迁移，侵袭和增殖能力在ESCC中起肿瘤促进作用。LncRNA CCAT1可以与原癌基因c-Myc相互作用，共同调控ESCC的发生与发展。因此lncRNA CCAT1有希望成为食管鳞状细胞癌诊断和治疗的分子靶点。

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