dsRNA介导的E-cadherin基因激活抑制膀胱肿瘤细胞增殖和转移及其机制研究

摘要

目的：设计合成靶向E-cadherin基因启动子的小双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),并检测其是否具有激活E-cadherin表达作用.进一步探讨小激活RNA(small activating RNA,saRNA)通过上调E-cadherin表达对抑制膀胱肿瘤的作用及其机制. 方法：依据saRNA设计原则,设计了靶向E-cadherin基因启动子区域的dsRNA(dsEcad-238、dsEcad-346).生物合成dsControl,dsEcad-238、dsEcad-346和内源性miR-373.将saRNA转染人膀胱癌细胞T24,5637和BIU-87,阴性对照组(dsContral)转染dsControl,空白组(Mock)转染等量的转试剂.采用RT-qPCR法和Western Blot检测转染72h后细胞中靶基因E-cadherin及β-catenin/TCF靶基因的mRNA和蛋白表达水平.采用划痕实验(Wound healing)及侵袭迁移(Transwell)实验检测细胞转移能力,流式细胞周期及细胞凋亡实验检测细胞周期分布及凋亡率.细胞免疫荧光检测E-cadherin和β-catenin在细胞中的表达及定位,然后用Western blot进一步验证β-catenin在细胞质和细胞核各组分的表达.合成靶向E-cadherin的小干扰RNA(siEcad)沉默E-cadherin的表达,反向验证saRNA对膀胱癌的抑制作用是通过激活E-cadherin的表达实现的. 结果：相对于Mock组和dsControl组,dsEcad-346转染膀胱癌细胞T24,5637和BIU-87后能显著激活E-cadherin基因表达,而转染dsEcad-238,E-cadherin基因表达无明显差异.相对于dsControl组,T24和5637细胞转染dsEcad-346和miR-373后细胞膜上E-cadherin表达升高;细胞周期阻滞于G0/G1期,凋亡细胞明显增加;划痕实验和Transwell实验证实转染dsEcad-346和miR-373后能显著抑制细胞的侵袭和迁移.细胞免疫荧光和Western blot结果证实,T24和5637转染dsEcad-346和miR-373后,细胞膜上β-catenin蛋白表达在升高,而细胞核内β-catenin蛋白表达降低,β-catenin从细胞核重新分布到细胞膜.RT-qPCR和Western blot检测结果显示转染dsEcad-346和miR-373后抑制β-catenin/TCF下游靶基因(c-MYC,MMP2,CyclinD1)蛋白和mRNA的表达.沉默实验表明,dsEcad-346和miR-373对膀胱癌的抑制作用在siEcad抑制E-cadherin基因表达后阻断. 结论：新设计合成的dsEcad-346能在膀胱肿瘤细胞中激活E-cadherin的表达.并且,saRNA通过激活E-cadherin的表达,促进β-catenin从细胞核重新分布到细胞膜并形成E-cadherin/β-catenin复合物并抑制β-catenin/TCF靶基因和膀胱肿瘤的增殖和转移.

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