鼠伤寒沙门氏菌脂多糖与CD209结合促进感染和播散

摘要

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium，S.T）是一种革兰氏阴性菌，可引起人和动物的胃肠炎到全身感染等传染病。鼠伤寒沙门氏菌是一种兼性厌氧菌，由于宿主和血清型的不同，导致各种食物和水源性疾病。根据它们的生化和基因组特性被分为六个亚种。迄今为止，肠道沙门氏菌包括2600多种血清型，其中大多数能够感染包括人类在内的多种植物和动物宿主[1]。食物中毒事件中最多的就是沙门氏菌污染，因此沙门氏菌是公众健康的重大威胁。鼠伤寒沙门氏菌可以穿透宿主粘膜表面并促发系统性扩散。然而，这个细菌传播的分子机制并不完全清楚。几十年来，人们已经接受沙门氏菌通过Ⅲ型分泌系统（Type three secretion system，T3SS）进入细胞。目前，鼠伤寒沙门氏菌的五个毒力岛(Salmonella pathogenicity island，SPI）:SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5，研究得比较清楚。鼠伤寒沙门氏菌的其他毒力基因或毒力因子如pSLT毒力质粒、黏附素、鞭毛和生物膜也有助于其在宿主体内生存和繁殖[2]。一项研究表明，通过使用其核心脂多糖（Core lipopolysaccharide，LOS）作为配体，鼠伤寒沙门氏菌能够结合人CD209（Cluster of Differentiation209，DC-SIGN）而CD209在人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染中作为受体，能通过劫持抗原呈递细胞（Antigen presenting cells，APC）来促进病毒的传播[3]。在本研究中，我们发现在37℃生长的鼠伤寒沙门氏菌与CD209相互作用，侵袭APC并传播到小鼠的局部淋巴结、脾脏和肝脏。此外我们发现LPS上O抗原表达以及加入甘露寡能够降低鼠伤寒沙门氏菌的播散和传染性。 主要结果如下： 1、派氏淋巴结在沙门氏菌播散中的作用不是必需的。 通过灌胃感染途径给予鼠伤寒沙门氏菌至野生型和Ltβr-/-小鼠（派氏淋巴结缺失）。在派氏淋巴结缺乏的小鼠中，沙门氏菌播散到肝脏和脾脏的细菌数量并没有减少，派氏淋巴结在沙门氏菌播散中的作用不是必需的。 2、鼠伤寒沙门氏菌的O抗原与温度有关 分别在26℃和37℃下培养的转入PAY100.1和PBR322质粒的沙门氏菌（记录为ST、ST-O+）进行侵袭实验，结果用绿色荧光蛋白标记鼠伤寒沙门氏菌后（ST-GFP和ST-GFP-O+）记录为，用流式细胞术检测O抗原的表达情况。结果显示26℃下ST-GFP和ST-GFP-O+的荧光强度没有差别，O抗原都表达，在37℃下ST-GFP-O+荧光强度大于ST-GFP，即37℃鼠伤寒沙门氏菌的O抗原表达被抑制。 3.CD209是鼠伤寒沙门氏菌的受体 结果显示在CHO细胞中鼠伤寒沙门氏菌在26℃下的侵袭的菌量高于37℃下的侵袭的菌量，这证明鼠伤寒沙门氏菌的侵袭力确实与温度相关；在CHO-SIGN R1细胞中鼠伤寒沙门氏菌在不同温度下的菌量也不一致，但是我们可以看出在CHO细胞中鼠伤寒沙门氏菌的侵袭力26℃下高于37℃，而在CHO-SIGN R1细胞中37℃要高于26℃，因此我们可以知道CD209是鼠伤寒沙门氏菌的受体。 4、O抗原的表达使鼠伤寒沙门氏菌致病性减弱 从感染小鼠的生存曲线中我们可以看出，ST PBR322生存期较短，存活率更低，而ST PAY100.1的存活率相对ST PBR322更高，即沙门氏菌感染小鼠后，O抗原继续表达的沙门氏菌的致病性相比O抗原被抑制的沙门氏菌有所降低。所以，从这个结果显示O抗原的抑制使沙门氏菌致病性增强。 用ST PAY100.1和ST PBR322细菌通过口胃途径感染小鼠。然后采集肝脏和脾脏并均一化。通过计算菌落数计算细菌向不同器官的播散率。从脾脏和肝脏中分离到比ST PAY100.1细菌更高数量的ST PBR322。外源性O抗原的表达抑制了鼠伤寒沙门氏菌扩散到脾脏和肝脏的能力。与ST PBR322感染的小鼠相比，ST PAY100.1表现出较小程度的肝肿大和脾肿大。通过荧光定量PCR定量检测器官中的细菌负荷量。结果表明可以看出从脾脏和肝脏和肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph nodes，MLN）中分离的细菌量ST PBR322比ST PAY100.1更高，因此说明O抗原的表达抑制了沙门氏菌在体内的播散。 5、Core LPS与CD209结合促进沙门氏菌的播散 有研究表明，甘露糖的结构与细菌的LPS结构类似，可以阻断core LPS和CD209的作用，我们通过用加入甘露糖的鼠伤寒沙门氏菌和野生型鼠伤寒沙门氏菌分别感染小鼠，从结果中我们可以看出加入了甘露糖的鼠伤寒沙门氏菌播散到肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏的菌量明显少于不加甘露糖的鼠伤寒沙门氏菌的播散到肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏的菌量。通过这个抑制性实验我们可以知道该作用确实是CD209和DC-SIGN的特异性作用。

目录

第一个书签之前

摘要

ABSTRACT

前言

材料与方法

1.1 细胞株

1.2 菌株与质粒

1.3 实验动物

1.4 主要实验试剂

1.5 主要仪器设备

2实验方法

2.1 细胞的复苏、培养及冻存

2.2 细菌的复苏、培养及冻存

2.3 细菌生长曲线

2.4 细胞株侵袭实验

2.5 取小鼠腹腔巨噬细胞与侵袭实验

2.6 小鼠存活率实验

2.7 测定沙门氏菌在小鼠体内的传播能力

2.8 体内吞噬作用测定

2.9 流式细胞术

2.10 数据处理和统计学分析

结果

1 派氏淋巴结在沙门氏菌播散中的作用不是必需的

2 鼠伤寒沙门氏菌的O抗原与温度有关

3 CD209是鼠伤寒沙门氏菌致病的受体

4 O抗原的表达使鼠伤寒沙门氏菌致病性减弱

5 O抗原的表达不利于鼠伤寒沙门氏菌的播散

6 LOS介导了体内巨噬细胞吞噬鼠伤寒沙门氏菌

7 甘露糖可以阻断Core LPS-CD209的作用，且甘露聚糖能降低鼠伤寒沙门氏菌的感染性

讨论

总结与展望

1全文总结

2展望

致谢

参考文献

附录1主要缩写词表（按字母顺序）

附录2综述

参考文献