法尼酯受体在盐酸小檗碱改善肥胖SD幼鼠脂代谢中的作用及肥胖子代血清生物标志物的研究

摘要

第一部分 法尼酯受体信号通路在盐酸小檗碱改善高脂诱导SD幼鼠脂代谢中的作用及机制 背景和目的：临床和动物研究表明，盐酸小檗碱可改善肥胖及其相关的代谢综合征、非酒精性脂肪肝等疾病中的代谢紊乱。小檗碱纠正脂质代谢紊乱的作用机制与脂质合成减少、脂肪酸氧化增加等相关。小檗碱对幼年动物模型脂代谢等内环境稳定的影响少有报道。核受体法尼酯受体X信号通路参与肥胖、代谢综合征等疾病的病理生理过程。法尼酯受体除调控胆汁酸代谢外，对肝脏脂质沉积等多方面均有参与。肝脏法尼酯受体在小檗碱条件脂代谢方面的作用研究甚少。高脂饮食诱导的幼年肥胖SD大鼠可作为于儿童青少年肥胖的实验室研究模型。本研究通过高脂饮食诱导肥胖大鼠、棕榈酸/油酸诱导原代肝细胞、HepG2细胞脂肪变三种模型，研究BBR对脂代谢的影响，以及法尼酯受体信号通路在其中的作用。方法：通过孕前10天、孕期、哺乳期母鼠高脂饮食、断乳后仔鼠高脂饮食喂养建立肥胖SD幼鼠模型，断乳后再分为小檗碱干预组和羧甲基纤维素钠对照组。干预3周，观察体重、血糖脂代谢、肝脂质代谢、肝组织相关分子表达;HepG2细胞、大鼠原代肝细胞分别经油酸/棕榈酸诱导脂肪变，观察小檗碱干预前后变化;法尼酯受体siRNA、抑制剂Z-Guggulsterone分别干预原代肝细胞、HepG2细胞，观察对小檗碱效应的影响。 结果：持续高脂饮食喂养大鼠体重、血甘油三酯、胆固醇、肝脏脂质沉积等明显超过对照组。高脂组体脂含量超过正常组。200mg/kg体重的小檗碱每天持续灌胃3周后体重较未干预组下降，体脂含量、血胆固醇、肝脏甘油三酯等均下降;HepG2细胞经1.0mmol/L油酸/0.5mmol/L棕榈酸共同培养24h后油红染色见脂滴聚集，细胞甘油三酯含量增加，脂肪酸氧化关键酶分子的mRNA、蛋白相对表达量下降;原代大鼠肝细胞接种成功后，经1.0mmol/L油酸/0.5mmol/L棕榈酸培养24h，细胞发生脂肪变，小檗碱共干预组的细胞脂滴减少、甘油三酯含量减低，脂肪酸氧化关键酶的表达上调;原代肝细胞经法尼酯受体 siRNA与小檗碱、油酸/棕榈酸同时处理后，小檗碱对细胞脂质代谢的改善效应减弱，法尼酯受体的mRNA、蛋白表达水平均明显下降，下游信号分子异二聚体小分子伴侣、棕榈酰基肉碱转移酶的表达上调;HepG2细胞系经Z-Guggulsterone、小檗碱、油酸/棕榈酸同时培养后，小檗碱对脂质代谢效应降低，法尼酯受体下游基因表达改变类似于法尼酯受体 siRNA干预的原代肝细胞。 结论：孕前、孕期、哺乳期、断乳后持续高脂喂养诱导SD幼鼠肥胖，体脂占体重百分比上升，肝脏脂质沉积，血液糖脂代谢紊乱;盐酸小檗碱可改善肥胖SD幼鼠的肥胖表型，及血液糖脂代谢紊乱、肝脏脂质沉积等内环境异常;法尼酯受体 siRNA降低盐酸小檗碱对脂肪变的原代肝细胞的脂质调控效应，法尼酯受体抑制剂同样减弱盐酸小檗碱对油酸/棕榈酸诱导脂肪变的HepG2细胞系的脂质异常，盐酸小檗碱可能用于青少年肥胖等治疗，肝脏法尼酯受体是其潜在效应机制之一。 第二部分成纤维生长因子1和Wnt1诱导的信号通路蛋白1在肥胖SD幼鼠和幼年中特征 背景和目的：Wnt1诱导的信号通路蛋白-1（Wnt1 inducible signaling pathway protein-1，WISP1）作为CCN家族的一员，被认为是肥胖和2型糖尿病的潜在靶点。WISP1可调节肥胖小鼠的低度炎症，血WISP1水平与肥胖和成人2型糖尿病有关。而另一种肥胖相关的生物活性标志物，成纤维细胞生长因子1（Fibroblast growth factor 1，FGF1）可调节肥胖小鼠的葡萄糖和脂质代谢。血清FGF1在2型糖尿病成年人中水平增加。本研究检测肥胖SD幼鼠和幼年的血清WISP1、FGF1水平，探讨WISP1与促炎细胞因子白细胞介素18（Interleukin 18，IL-18）的关系。盐酸小檗碱干预的SD幼鼠和生活方式干预的肥胖幼年体重减轻后，血清FGF1的变化及其与糖脂代谢的关系。 对象和方法：选取44名肥胖儿童和青少年（5~15岁），同时以儿童保健门诊健康体检的44名体重正常的健康小儿作为对照;44例肥胖幼年中，经过6个月控制饮食和每日规律运动的生活方式干预后，体重减轻超过5%以上的患儿39例纳入FGF1相关的后续研究。记录所有研究对象的体格及糖脂代谢等实验室指标，通过酶联免疫吸附测定法测定FGF1、WISP1和IL-18的血清水平。选取第一部分研究中的高脂饮食诱导肥胖、盐酸小檗碱干预、普通饮食共3组SD幼鼠，留取空腹8h血清标本，检测FGF1、WISP1和IL-18的水平。 结果：肥胖幼年的WISP1水平高于对照组（1364.08±18.69 vs 1735.44±15.29 pg/mL），肥胖幼鼠的血清WISP1水平高于普通饮食组; 肥胖组的血清WISP1水平与体块指数（Body mass index，BMI）和BMI-z呈正相关（r=0.392，P=0.008;r=0.474，P=0.001）;肥胖小儿循环IL-18增加（295.87±13.30 vs 1229.06±29.42pg/mL），肥胖幼鼠的血清IL-18增高;肥胖幼年的血清WISP1水平与IL-18（r=0.542， P=0.000），脂联素（r=0.585，P=0.000）和瘦素（r=0.592，P=0.000）呈正 相关，肥胖幼鼠的血清WISP1也与IL-18呈正相关;多变量逐步线性回归分析显示，在调整肥胖幼年的BMI、腰围、空腹胰岛素、稳态模型胰岛素抵抗指数（Homeostatic model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）和糖化血红蛋白（Hemoglobin A1c，HbA1c）后，高水平血清IL-18是高水平血清WISP1的主要决定因素（β=0.542，P=0.000）。肥胖幼年和幼鼠中血清FGF1水平增加，肥胖小儿的血清FGF1水平与BMI和腰围呈正相关（r=0.377，P=0.012;r=0.301， P=0.047）;多元逐步线性回归分析显示，肥胖幼年血清FGF1水平与HbA1c和HOMA-IR呈正相关（β=0.371，P=0.008;β=0.323，P=0.021）;肥胖幼年经生活方式干预后的体重减轻（2.34±0.11 kg）伴随着血清FGF1水平显著降低（7.23±0.44 pg/ml），肥胖SD幼鼠经盐酸小檗碱干预后体重较未干预组降低，体脂含量下降，血清FGF1水平下降;肥胖儿童和青少年HOMA-IR和低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）（β=0.277，P=0.020;β=0.474，P<0.001;β=0.320，P=0.008）与FGF1的降低显著相关。 结论：高脂饮食诱导肥胖幼鼠和肥胖幼年的血清WISP1和FGF1水平增高，增高的WISP1和FGF1可能增加胰岛素抵抗的风险;WISP1对肥胖儿童和青少年糖脂代谢的影响可能是由炎性因子IL-18所调控;盐酸小檗碱干预后的肥胖SD幼鼠和生活方式干预后的肥胖幼年血清FGF1水平下降，这种降低的血清FGF1水平与肥胖者体重减轻后、胰岛素抵抗改善有关，WISP1和FGF1可能对肥胖儿童和青少年的胰岛素抵抗有潜在的治疗作用。

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摘要

ABSTRACT

前言

第一部分

1 建立BBR干预的高脂饮食诱导幼年肥胖大鼠模型

1.1 实验对象

1.2 实验方法及材料

1.3 实验结果

1.4 小结

2 建立BBR干预的HepG2 细胞脂肪变性模型

2.1 实验对象

2.2 实验方法及材料

2.3 实验结果

2.4 小结

3 建立BBR干预原代大鼠肝细胞脂肪变性模型

3.1 实验对象

3.2实验方法及材料

3.3 实验结果及小结

4 法尼酯受体信号通路在BBR干预脂肪变肝脏和肝细胞中的作用

4.1 实验方法及材料

4.2 实验结果

4.3 小结

5讨论

第二部分

2.1 研究对象和方法

2.2 结果

2.3 讨论

综述

参考文献

附录

致谢