HLA遗传多态性与MDR/RR-TB和HIV易感性的关联研究及其在新型结核诊断肽筛选中的应用

摘要

人免疫缺陷病毒感染（HIV）及其引起的获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的流行、耐多药/利福平耐药结核（MDR/RR-TB）的传播已成为导致世界范围内结核疫情复燃及蔓延的重要原因。而个体是否容易罹患AIDS或MDR/RR-TB，除与病原体传播有关，还与宿主是否携带易感基因有关。来自世界各地的研究表明，HIV或TB感染及其疾病进展的宿主遗传易感性部分取决于人类白细胞抗原（HLA）系统。TB/HIV双重感染对结核诊断构成了巨大的挑战，由于艾滋病继发的严重免疫缺陷，易使现有结核诊断方法，甚至以ESAT-6和CFP-10作为反应刺激物的结核感染IFN-γ释放实验呈假阴性。 研究目的：研究一调查湖北汉族人群中耐多药/利福平耐药结核病（MDR/RR-TB）患者的人类白细胞抗原（HLA）A、B、DRB1位点的高分辨率等位基因和单体型频率的分布特征,并与同一地区药物敏感结核病（DS-TB）患者相比较,拟发现HLA-A、B、DRB1等位基因及其单体型与耐多药/利福平耐药结核（MDR/RR-TB）易感性的关系。 研究二调查华中地区HIV/AIDS人群HLA-A、B、C位点的高分辨率等位基因的分布特征,以筛选HIV/AIDS人群经典MHC-Ⅰ高频分子（MHC-Ⅰa），利用高频率MHC-Ⅰa限制性表位筛选针对该群体的结核分枝杆菌特异性刺激抗原肽，刺激结核特异性CD8+细胞分泌IFN-γ，以提高HIV/AIDS人群结核感染的早期诊断率。 研究方法:在第一项研究中，抽取来自湖北汉族人群的174例耐多药/利福平耐药结核病患者（观察组）和838例药物敏感结核病患者（对照组）的血样,使用聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针（PCR-SSOP）技术进行4位数HLA-A、B、DRB1等位基因分型，比较两组间HLA-A、B、DRB1等位基因和单体型频率。使用Arlequin ver3.5软件分析两组HLA-A、B、DRB1等位基因和单体型的频率,使用Epi Info7软件和SPSS22.0软件分析两组间HLA等位基因的差异。 第二项研究分以下2步进行： 1.HIV/AIDS人群MHC-Ⅰa高频分子的筛选：将424名HIV-1感染者作为研究对象,以836名同一地区HIV阴性健康人群为对照,采用PCR-SSOP及PCR-SBT技术进行HLA-A、B、C等位基因的基因分型。使用Arlequin ver3.0软件分析两组HLA-A、B、C等位基因和单体型的频率,使用Epi Info7软件和SPSS18.0软件分析华中地区HIV/AIDS人群的经典Ⅰ类人类白细胞抗原（HLA-A、B、C）等位基因分布特点，确定该人群经典MHC-Ⅰ高频分子。 2.以结核分枝杆菌差异区（region of differences,RD）编码蛋白为候选抗原，通过计算机软件预测候选抗原上与HIV/AIDS人群MHC-Ⅰa高频分子高度亲和的表位。人工合成含HIV/AIDS人群经典MHC-Ⅰ高频分子高亲和力表位的多肽作为刺激原，以培养证实的结核病患者去除CD4+、CD56+细胞的外周血单个核细胞（PBMC）为阳性样本，以有BCG接种史的健康对照的外周血单个核细胞（PBMC）为阴性样本，进行IFN-γELISpot，选择对TB样本有刺激效应且对健康对照无刺激效应的多肽。用筛选所得混合多肽池为IGRA试剂，与重组结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6-培养滤液蛋白10融合抗原（recombinant fusion protein of early secretory antigenic target6kDa and culture filtrateprotein10kDa，rESAT6/CFP10）比较在HIV感染人群中的灵敏度和特异度，以验证CD8抗原肽是否能提高rEAST6/CFP10刺激TB/HIV患者外周血IFN-γ释放反应率及强度。 研究结果：研究一，对所测数据进行统计分析显示，对照组的所有位点均不偏离哈迪-温伯格平衡（HWE）。多因素Logistic回归分析显示，除年龄较大(p＜0.0001；OR=10.9，95%CI7.6–15.8)、既往治疗史(p＜0.0001；OR=11.0，95%CI7.2–16.7)和治疗依从性差（p＜0.0001；OR=12.9，95％CI8.4-20.0）外，等位基因DRB1*08:01(p＜0.0001；OR=174.5，95%CI15.3–1987.2)是MDR/RR-TB的独立预测因子。而在初治结核病例亚组中，DRB1*08:01（p＜0.0001；OR=80.3，95％CI7.0-917.1）和年龄较大（p＜0.0001；OR=3.9，95％CI2.4-6.4）是原发MDR/RR-TB的独立易感因素。 研究二，首先测得华中地区HIV/AIDS人群MHC-Ⅰa高频分子为HLA-A*11:01（27.7%）、HLA-B*46:01（16.7%）、HLA-A*24:02（15.6%）、HLA-A*02:07（14.2%）、HLA-B*40:01（12.7%）、HLA-C*12:02（10.7%）、HLA-C*03:04（9.4%）、HLA-A*02:01（9.0%）、HLA-C*07:02（8.0%）、HLA-B*13:01（7.5%）、HLA-A*33:03（6.6%）、HLA-C*07:01（5.8%）、HLA-C*03:01（5.5%）、HLA-C*04:05（5.3%）、HLA-B*58:01（5.3%），通过调整年龄和性别混杂因素后的多因素Logistic回归分析显示,HIV-1阳性组的HLA-A*02:06、HLA-B*15:01等位基因亚型频率高于HIV-1阴性组。然后，利用网络表位预测工具NetMHCpan3.0服务器预测并筛选与HIV感染人群MHC-Ⅰa高频分子高度亲和的免疫优势表位,并通过体外筛选试验，最终获得8个重叠多肽池，Rv0222176-191、Rv1980c122-138、Rv1985c105-120、Rv3425141-165、Rv3873133-151、Rv3873158-166、Rv387878-86、Rv3879c673-690，可刺激结核患者外周血CD8+T淋巴细胞产生γ干扰素，但对健康对照外周血单个核细胞无刺激效应。在检测25例TB/HIV双重感染血样时，由这8个重叠多肽池混合而成的IGRA刺激剂（CP）的灵敏度与rESAT6/CFP10（EC）的灵敏度均较低（68%vs48%，p＞0.05），但二者共同作为IGRA刺激剂（CP+EC）时灵敏度达92%，显著高于rESAT6/CFP10（χ2=11.5238，p=0.00068），且不影响特异性。 研究结论：研究一，推证了人类自身遗传因素中HLA基因多态性影响个体对MDR/RR-TB的易感性。我们的研究结果表明，综合结核病患者的临床和宿主遗传信息可能有助于MDR/RR-TB的预测和早期发现。 研究二，根据HIV/AIDS人群HLA-A、B、C等位基因分布特点筛选出来的经典MHC-Ⅰ限制性结核抗原肽，有提高IGRAs在HIV/AIDS人群中的结核感染检测灵敏度的潜力。

目录

OLE_LINK12