细胞色素P450表氧化酶2J2及其代谢产物EETs改善心肌梗死后心功能及其机制研究

摘要

研究背景与目的：心肌梗死（Myocardial infarction, MI）是临床上常见的急危重症，以高发病率及高病死率成为威胁人类健康和生命的主要原因，其病理生理基础为冠状动脉粥样硬化性疾病(Coronary atherosclerotic disease, CAD)。冠状动脉粥样硬化性疾病是由于粥样斑块阻塞了冠状动脉，在血管壁激活的炎症不稳定时期会导致斑块的不稳定以致斑块脱落而阻塞冠状动脉时，患者则出现心肌梗死。心肌梗死之后，因受损心肌的修复而发生一系列炎症反应，心肌细胞的坏死与凋亡，血管生成，其中以血管生成对心脏的修复起着至关重要的作用。受损的心脏区域血管生成及供血不足是导致心脏的心室重构且进展为心力衰竭的重要事件。尽管心脏搭桥手术，经皮冠状动脉介入等先进重建血供的治疗手段应用使得一部分病人得到了有效的治疗，但依然有一些病人死亡或者发生了心力衰竭，说明这些治疗方式依然有一些缺点和局限性，比如心肌无复流现象以及术后血管再狭窄和闭塞等。在心梗发生时，心肌细胞氧浓度下降，缺氧诱导因子-1（Hif1-α）蛋白的表达升高会促进心肌自身内在的血管生成，但是这对于维持正常的心脏供血是远远不够的。因此，心肌缺血后的血管生成的治疗对保护心脏功能、改善远期预后以及延缓心力衰竭的进展有着重要的意义。 细胞色素 P450 表氧化酶可将花生四烯酸转化为具有生物活性的环氧二十碳三烯酸（EETs），这是一群具有心脏保护的代谢产物，其包括四个异构体：5, 6-EET, 8, 9-EET,11, 12-EET, 和14, 15-EET。其主要的代谢产物是11, 12-EET和14, 15-EET。 EETs在可溶性环氧化物水解酶 (Soluble epoxide hydrolase, sEH)的水解作用下，EETs被进一步分解为一类化学性质更稳定且生物活性更低的化合物—二羟基-二十碳-三烯酸(Dihydroxyeicosatrienoic acids, DHETs)。细胞色素P450表氧化酶2J2是唯一存在于人类的 CYP2J 家族，它在人冠状动脉内皮细胞，平滑肌细胞和心肌细胞都有丰富的表达。之前关于EETs与血管生成的研究很少涉及到心梗后心衰这一领域，因此，本研究主要是为了探索细胞色素P450表氧化酶2J2系统对血管生成的影响及对心衰的预后情况及其可能的机制。 研究方法：在动物实验部分，我们采用 8-10 周内皮特异性过表达 CYP2J2 的Sprague Dawley雄性大鼠（TG-type,带有Tie2启动子）与同窝出生及周龄相匹配的野生型Sprague Dawley雄性大鼠(Wild-type)随机分为四组：WT-Sham组，TG-Sham组， WT-MI组，TG-MI组。WT-MI组和TG-MI组进行左前降支结扎术，而WT-Sham与TG-Sham组为假手术组，与手术组操作相同只是不结扎左前降支。在心梗8周之后，先给实验大鼠进正电子发射型计算机断层显像（PET）检测心肌血流量，然后进行左心室 M 超声及左心导管检测。心导管做完后，从实验鼠颈动脉采血，离心后取上层血浆进行 ELISA 检测。然后取出大鼠心脏拍照，一部分大鼠心脏进行石蜡包埋进行HE染色、Masson染色，WGA染色，另一部分心脏组织用OCT包埋放在-80℃冰箱中进行后续的免疫荧光染色。余下的心脏组织进行Western blotting以及RT-PCR检测。 在细胞实验部分，我们将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在常氧和缺氧的条件下培养16个小时，使用CYP2J2的主要代谢产物11，12-EET及其拮抗剂14，15-EEZE干预，来观察11，12-EET对内皮细胞的小管生成作用，更深入的机制研究用Notch1的siRNA和抑制剂DAPT干预进行机制研究。 研究结果： 一、CYP2J2过表达能够明显减少大鼠心肌梗死后的心梗面积，减轻心梗后梗死周边区心肌细胞的肥厚。 二、CYP2J2过表达可以促进血管生成，从而增加心肌血流量来改善心梗后心功能障碍。 三、CYP2J2过表达可以促进11，12-EET、14，15-EET、5, 6-EET、的分泌。 四、在体外实验中，11，12-EET可以使人脐静脉内皮细胞在常氧和缺氧的情况下增加VEGF-A以及bFGF蛋白的合成以及促进小管生成。 五、CYP2J2 代谢花生四烯酸产生 11 ， 12-EET 增加血管生成的机制是通过Notch1/Jagged1通路来完成的，11，12-EET可以促进Notch1在内皮细胞中从胞浆进入胞核，从而作用于促进血管生成的靶基因，而11，12-EET增加胞浆中Notch1表达的机制是在常氧的情况下增加 gama-分泌酶的活性，而在缺氧的时候增加 gama-分泌酶的生成，从而使Notch1的表达增加。 结论：综上所述，内皮细胞特异性过表达 CYP2J2 可以通过促进血管生成来延缓心力衰竭的进展，其作用机制是通过Notch1/Jagged1通路来实现的。

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