声明
1 绪 论
1.1 恶性黑色素瘤治疗现状
1.1.1传统恶性黑色素瘤治疗方案
1.1.2恶性黑色素瘤的生物治疗
1.1.3 恶性黑色素瘤的免疫治疗
1.2 肿瘤干细胞假说
1.2.1肿瘤干细胞假说的起源
1.2.2肿瘤干细胞假说存在争议
1.2.3肿瘤再生细胞
1.3 肿瘤异质性与肿瘤转移模型
1.3.1肿瘤异质性
1.3.2 肿瘤转移模型
1.4 肿瘤细胞休眠
1.4.1肿瘤细胞休眠机制
1.4.2研究肿瘤细胞休眠机制的临床意义
1.5 干性基因Sox2
1.5.1 Sox2在胚胎发育中的作用
1.5.2Sox2在肿瘤发生发展中的作用
1.6 基因编辑技术
1.6.1 CRISPR/Cas9基因编辑技术
1.7 本研究内容及意义
2 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验细胞
2.1.2 实验动物
2.1.3实验试剂
2.1.4试剂盒
2.1.5抗体
2.2 主要实验仪器
2.3 实验方法
2.3.1细胞复苏
2.3.2细胞传代（2D细胞）
2.3.3细胞冻存
2.3.4 TRC（3D细胞）的培养
2.3.5 TRC的收集
2.3.6细胞转染
2.3.7 Sox2 shRNA稳转细胞系的筛选
2.3.8 Sox2 knockout细胞系的构建及筛选
2.3.9基因组DNA的提取（E.Z.N.A.TM MicroElute Genomic DNA Kit）
2.3.10质粒的转化
2.3.11去内毒素提取质粒DNA（E.Z.N.A.（R） Endo-free Plasmid DNA Mini Kit）
2.3.12细胞总RNA的提取
2.3.13实时荧光定量PCR（Real-time PCR）（HiScript（R）Ⅱ One Step qRT-PCR SYBR（R） Green Kit）
2.3.14染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)（EZ ChIPTM kit 22 assays）与PCR分析
2.3.15细胞核蛋白与细胞浆蛋白的提取（细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒）
2.3.16蛋白免疫印迹（Western Blotting）
2.3.17免疫荧光（Immunofluorescence, IF）
2.3.18流式细胞分析（Flow Cytometry，FCM）
2.3.19细胞凋亡检测（Annexin V-FITC Apoptosis Kit）
2.3.20细胞周期检测（BD PharmingenTM FITC BrdU Flow Kit）
2.3.21葡萄糖摄取实验（葡萄糖氧化酶法测定试剂盒）
2.3.22β半乳糖苷酶活性检测实验（Senescence β-Galactosidase Staining Kit）
2.3.23小鼠实验
2.3.24细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）杀伤实验
2.3.25数据分析
3 实验结果与分析
3.1 Sox2的表达水平与小鼠黑色素瘤再生细胞的增殖密切相关
3.1.1Sox2 KO细胞系的构建
3.1.2 Sox2低表达和过表达小鼠黑色素瘤再生细胞的鉴定
3.1.3 低表达Sox2抑制了小鼠黑色素瘤再生细胞的增殖
3.2 低表达Sox2介导黑色素瘤再生细胞休眠
3.2.1低表达Sox2的小鼠黑色素瘤再生细胞产生细胞周期阻滞
3.2.2低表达Sox2的小鼠黑色素瘤再生细胞表达高水平的休眠标志物
3.2.3低表达Sox2的小鼠黑色素瘤再生细胞代谢减慢且不衰老
3.2.4低表达Sox2的小鼠黑色素瘤再生细胞的耐药性增强
3.2.5低表达Sox2的小鼠黑色素瘤再生细胞激活IDO1-AhR通路
3.2.6转染Sox2 siRNA也引起小鼠黑色素瘤再生细胞的休眠
3.2.7低表达Sox2介导人源恶性黑色素瘤细胞的休眠
3.3 完全敲除Sox2导致肿瘤再生细胞退出休眠
3.3.1 Sox2 KO小鼠黑色素瘤再生细胞仍保有增殖能力
3.3.2 Sox2 KO小鼠黑色素瘤再生细胞不表达休眠标志物
3.3.3 Sox2 KO小鼠黑色素瘤再生细胞失去部分CD133介导的干性
3.3.4 Sox2 KO小鼠黑色素瘤再生细胞的耐药性明显降低
3.3.5 Sox2 KO小鼠黑色素瘤再生细胞与2D小鼠黑色素瘤细胞的比较
3.3.6 Sox2 KO小鼠黑色素瘤再生细胞中转染Sox2 shRNA不引起细胞休眠
3.4激活STAT3/p53导致Sox2 KO小鼠黑色素瘤再生细胞退出休眠
3.4.1 p53高表达降低Sox2 KO小鼠黑色素瘤再生细胞耐药性
3.4.2 Sox2 KO小鼠黑色素瘤再生细胞中STAT3/p53通路激活
3.5 低表达Sox2介导在体黑色素瘤组织的休眠
3.5.1低表达Sox2对成瘤率的影响
3.5.2低表达Sox2抑制肿瘤组织的生长
3.5.3 Sox2 KO小鼠黑色素瘤再生细胞在体内更易凋亡
3.6 单细胞分析显示低表达Sox2与肿瘤再生细胞休眠紧密相关
3.6.1 对2D细胞不同Sox2处理的检测分析
3.6.2 低表达Sox2介导在体黑色素瘤组织表达休眠标志物
3.7 本章小结
4 讨论与展望
致谢
参考文献
附录 攻读博士学位期间发表的论文
