副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）HD1.7产肽条件优化及肽类分离研究

摘要

由乳酸菌产生的抗菌肽(antibacterial-peptides，ABP)作为新一代食品防腐剂，具有安全性好、生产成本低等特点，越来越受到人们的重视。副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HD1.7产生的抗菌肽，对多种革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌以及酵母菌都有抑制作用，同时具有耐高温等特点，可作为新型食品防腐剂。本文对副干酪乳杆菌HD1.7所产抗菌肽进行了研究，优化其培养基成分以提高其产肽量，对其产生的抗菌肽进行了分离纯化，并对其生物学特性进行了初步探索。这些研究为该菌投入生产，广泛应用于食品药品、探讨抗菌肽对指示菌的作用位点、以及研究抗菌肽基因的克隆表达等工作奠定了基础。 本研究通过以廉价的工业原料取代高成本的实验室原料，对副干酪乳杆菌HD1.7培养基成分进行比较，确定该菌产抗菌肽的最佳发酵培养基配方为：工业蛋白胨30g/L，葡萄糖10g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，亚硫酸钠O．2g/L，乙酸钠7g/L，硫酸镁O．1g/L，硫酸锰0.025g/L，吐温-80 1.0mL/L，调节pH5.5。 对副干酪乳杆菌HD1.7抗菌肽进行分离纯化，通过阳离子交换层析(CM Sepharose Fast Flow)按照抗菌肽在溶液中的离子特性对其初步分离；对有抑菌活性的组分依据分子量大小不同，利用凝胶层析(Sephadex G-25、G-10)进行逐层分离。共分离得到5个活性组分，G10a，G10b，G10c，G10d和G10e，其中G10d的效价最高。根据SDS-PAGE结果，估测此抗菌肽分子量小于10kDa。 抗菌肽的生物学特性研究表明，副干酪乳杆菌HD1.7抗菌肽在酸性条件下抑菌活性高，在pH4.0时，抑菌活性最高；具有很好的热稳定性，在121℃处理15min仍有抑菌活性；它不仅抑制革兰氏阳性菌，还能抑制革兰氏阴性菌，对酵母菌也有抑制作用，有很广的抑菌谱；该抗菌肽对胰蛋白酶敏感，但对胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、K蛋白酶不敏感。该抗菌肽可抑制枯草芽孢杆菌的生长，但不能杀死细菌。粗产物在4℃长期保存仍具有很强的抑菌活性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

1.1乳酸菌

1.2乳酸菌抗菌肽

1.2.1乳酸杆菌产生的抗菌肽

1.2.2乳酸球菌产生的抗菌肽

1.3乳酸菌抗菌肽的分类及作用机理

1.4乳酸菌抗菌肽的应用

1.4.1在食品方面的应用

1.4.2在医药方面的应用

1.5乳酸菌抗菌肽发酵条件的研究

1.5.1培养基成分对抗菌肽产量的影响

1.5.2培养方式对抗菌肽产量的影响

1.6乳酸菌抗菌肽分离纯化的研究

1.6.1层析技术

1.6.2蛋白质定性和定量分析技术

1.6.3蛋白质的鉴定-质谱分析

1.6.4用肽质量指纹图谱鉴定蛋白质

1.7本研究的目的和意义

1.8本研究的主要技术路线

第2章材料与方法

2.1材料

2.1.1菌种

2.1.2培养基

2.1.3主要试剂及药品

2.1.4试剂盒

2.1.5主要仪器设备

2.2方法

2.2.1种子液的制备

2.2.2发酵上清液(样品)的制备

2.2.3抑菌活性的检测

2.2.4乳酸对抑菌效果的影响

2.2.5抗菌肽效价的确定

2.2.6菌体生长及产抗菌肽动态变化过程的研究

2.2.7菌株产抗菌肽培养基成分优化

2.2.8抗菌肽分离纯化研究

2.2.9抗菌肽生物学特性的研究

第3章结果与分析

3.1乳酸对抑菌效果的影响

3.2副干酪乳杆菌HD1.7产抗茵肽效价标准曲线的绘制

3.3菌体生长及产抗菌肽动态变化过程的研究

3.4菌株产抗菌肽发酵条件优化

3.4.1发酵培养基成分氮源及碳源的确定

3.4.2培养基中其他成分的确定

3.5抗菌肽分离纯化研究

3.5.1最大吸收波长的确定

3.5.2弱阳离子交换层析

3.5.3凝胶层析

3.5.4高效液相色谱

3.5.5蛋白浓度测定

3.5.6聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.6抗菌肽生物学特性的研究

3.6.1不同pH对抗菌肽粗提产物活性的影响

3.6.2抗菌肽粗提产物的热稳定性

3.6.3抗菌肽的抑菌谱及最低抑菌浓度

3.6.4抗菌肽对不同蛋白酶的敏感性

3.6.5抗菌肽的作用方式

3.6.6抗菌肽粗提产物保质期对效价的影响

第4章讨论

结论

参考文献

附录

致谢