纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）产纳他霉素高产菌株的选育

摘要

纳他霉素(Natamycin)为二十六元多烯大环内酯类抗生素，一种高效、广谱、安全的抗真菌生物食品防腐剂，主要由纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chatanoogensis)和褐黄孢链霉菌(Streptomycesgilvosporeus)等产生菌经发酵过程产生。为了提高纳他霉素的产量，本论文对纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)HDMNTE-01的培养方式、发酵液中纳他霉素的检测方法及纳他霉素高产菌株的选育进行了系统的研究。 首先对管碟法测定发酵液中纳他霉素的各项参数进行了研究。结果表明，将检测菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W23培养至107CFU／mL，以10％的量加入到上层培养基中制各双层检测平板，在牛津杯中加入70μL经甲醇提取的检测液，培养24h后观察结果所得数据符合要求。 比较6种不同的斜面培养基和4种不同的种子培养基，选择出培养和保藏HDMNTE-01的最佳培养基配方。孢子斜面培养基(g／L)：葡萄糖10、淀粉10、黄豆饼粉10、麦芽抽提物3、酵母抽提物3、MgSO4·7H2O 1、K2HPO4 0.5、NaCl 2、CaCO3 3、琼脂20；种子培养基配方(g／L)：淀粉10、黄豆饼粉10、蛋白胨6、玉米浆6、葡萄糖10、MgSO4·7H2O 1、K2HPO4 0.5、NaCl 2、CaCO35。 研究了HDMNTE-01摇瓶发酵的种龄、接种量、装液量、发酵培养基初始pH、温度、转数等对发酵的影响，得到最佳发酵条件为：接种量6％、装液量为25mL/50mL，发酵液初始pH值为7.0，发酵96h为代谢产物最佳收获时间；摇床温度为28℃；转数为220r／min。 根据纳他霉素的生物合成途径和代谢调节机理，对纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌HDMNTE-01进行诱变，选育高产菌株。以琼脂块法筛选到的103号菌为出发菌株，先后分别经紫外线、DES、吖啶橙、紫外线+氯化锂复合诱变后，共筛选乙酸钠、丙酸钠、硫酸链霉素抗性突变株共441株，采用琼脂块法分离纯化后，经发酵液纳他霉素含量测定，最终获得高产突变株F-99，其摇瓶发酵效价达1.78g／L，比出发菌株提高302％。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章前言

1.1纳他霉素的概述

1.1.1发现与命名

1.1.2理化性质

1.1.3纳他霉素的抑菌作用

1.1.4纳他霉素的应用

1.1.5纳他霉素的检测方法

1.2纳他霉素的生产概况

1.2.1纳他霉素产生菌

1.2.2纳他霉素分离提取

1.3抗生素产生菌的诱变育种的研究概况

1.3.1诱变方法

1.3.2突变株的筛选

1.3.3诱变剂量的选择

1.4本论文研究的目的及意义

1.4.1本论文研究的目的

1.4.2本论文研究的意义

1.4.3实验的技术路线

第2章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株

2.1.2主要药品

2.1.3仪器设备

2.1.4培养基

2.1.5相关溶液

2.2实验方法

2.2.1菌株的活化和培养

2.2.2纳他霉素生物检测方法

2.2.3霉菌培养方法的优化

2.2.4诱变

第3章结果与分析

3.1纳他霉素检测方法的确定

3.1.1敏感菌的筛选

3.1.2敏感菌浓度的确定

3.1.3发酵液中纳他霉素提取剂及其用量的确定

3.1.4标准曲线的绘制

3.2纳塔尔链霉菌产纳他霉素培养方式的确立

3.2.1斜面孢子培养基和培养时间的确定

3.2.2种子液培养基和培养时间的确定

3.1.3最佳接种量的确定

3.1.4摇床发酵转数的确定

3.1.5摇床发酵温度的确定

3.1.6溶解氧对纳那他霉素产量的影响

3.1.7发酵培养基初始pH值对发酵的影响

3.1.8菌株生长曲线和纳他霉素积累曲线

3.3纳他霉素产生菌的诱变育种

3.3.1出发菌株的选择

3.3.2最小抑菌浓度的确定

3.3.3紫外线诱变选育纳他霉素生产菌

3.3.4硫酸二乙酯(DES)诱变选育纳他霉素产生菌

3.3.5吖啶橙诱变选育纳他霉素生产菌

3.3.6紫外线+氯化锂诱变选育纳他霉素生产菌

3.3.7高产突变株F-99的遗传稳定性及原始菌株抑菌圈对比

3.3.8各种诱变因子诱变后菌落形态的变异

3.3.9抗性筛选剂的比较

第4章讨论

4.1检测方法

4.2培养方式

4.3菌种诱变

4.3.1诱变结果

4.3.2四种诱变方法效果的比较

4.3.3诱变方法和诱变顺序的差异可能导致诱变结果的不同

4.4展望

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间所发表的论文