黄檗（Phellodendron amurense）丛枝菌根真菌鉴定及菌群结构分析

摘要

黄檗(Phellodendron amurense Rupr.)属芸香科阔叶乔木，是我国东北阔叶红松林的重要伴生树种，也是东北著名的三大硬阔之一，为珍贵的药用植物和用材树种。由于不合理的药材资源采收和过度采伐，黄檗这一野生资源已处于濒危状态。丛枝菌根(arbuscular mycohizal，AM)真菌是自然界中普遍存在的一种寡营养活体微生物，能与绝大多数陆生植物根系形成共生体。AM真菌能够提高植物对营养元素的吸收，促进植物生长，改善植物对干旱及毒性污染的耐受性，增强植物的抗病性等。目前，关于黄檗AM真菌的研究仍处于起步阶段，而黄檗AM真菌的鉴定及菌群结构分析国内外尚无人问津，我们开展本项研究，拟采用分子生物学方法鉴定和分析黄檗AM真菌及菌群结构，因此，本项研究不仅对丰富和发展群落生态学具有重要的理论意义，而且对于收集、保护及利用AM真菌微生物资源，为黄檗菌根功能菌群的研究奠定了基础。 从东北林业大学林场采集黄檗根系及根际土壤，采用碱解离-酸性品红染色法对黄檗根系进行染色，湿筛倾析-蔗糖离心法分离黄檗根际土壤AM真菌孢子。采用形态学和分子生物学方法对分离得到的AM真菌孢子进行分类鉴定，并应用Nested-PCR技术检测根际土壤AM真菌侵染黄檗根系情况。依据AM真菌孢子形态特征及25S rDNA D1／D2区域序列分析鉴定出黄檗根际土壤中存在4种AM真菌：根内球囊霉(Glomus intraradices)，摩西球囊霉(Glomus mosseae)，美丽盾孢囊霉(Scutellospora calospora)和变形球囊霉(Glomus versiforme)，而应用Nested-PCR技术从黄檗根内只检测到了G．intraradices，G．mosseae和Scu．calospora，表明G．versiforme未侵染黄檗根系。 同时，采用Nested-PCR技术扩增黄檗菌根及根际土壤AM真菌18S rDNANS31／Glol区域，利用该产物优化AM真菌DGGE条件，并结合测序、系统发育分析及DGGE图谱分析技术对黄檗AM真菌菌群结构进行分析。结果表明，Nested-PCR技术具有较高的灵敏性，可有效的从微量DNA中扩增出约230bp的目的片段；AM真菌最佳DGGE条件为：凝胶变性梯度范围30％-60％，纯化后的PCR产物作为DGGE上样样品，丙烯酰胺浓度8.0％，电泳电压130V，电泳时间8h，电泳温度60℃；DGGE条带测序及图谱分析表明，2种样品具有不同的DGGE指纹图谱特征，DGGE带谱在条带的数量、亮度、优势度等方面均存在较大差异；全部序列可分为3类菌群，即球囊霉属、盾孢囊霉属和植物病原微生物，其中Glomus sp．(EF177624)和Glomus sp．(DQ085205)分别为黄檗根系和根际土壤样品中最具优势的AM真菌。

目录

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第1章绪论

1.1菌根概述

1.2丛枝菌根真菌系统分类

1.3丛枝菌根的生理生态功能

1.3.1促进寄主植物对磷素的吸收利用

1.3.2促进寄主植物对氮索的吸收利用

1.3.3促进寄主植物对其它营养元素的吸收利用

1.3.4刺激宿主植物生长

1.3.5增强宿主植物的抗逆性

1.3.6提高宿主植物的抗病性

1.4丛枝菌根真菌的鉴定方法

1.4.1形态学方法

1.4.2组织化学方法

1.4.3生态学方法

1.4.4分子生物学方法

1.5丛枝菌根真菌菌群结构研究方法

1.5.1传统形态学方法

1.5.2生物标记法

1.5.3分子生物学方法

1.6本研究的目的及意义

第2章材料与方法

2.1试验材料

2.1.1供试材料

2.1.2供试菌种及质粒

2.1.3扩增引物

2.1.4主要生化及分子生物学试剂

2.1.5培养基及试剂盒

2.1.6主要仪器设备

2.2黄檗丛枝菌根真菌鉴定

2.2.1根系的碱解离一酸性品红染色方法

2.2.2根际土壤AM真菌孢子分离

2.2.3 AM真菌形态学鉴定

2.2.4 AM真菌单孢25S rDNA D1/D2区序列分析

2.2.5 AM真菌种特异性引物的设计及其侵染根检测

2.3菌群结构分析

2.3.1根际土壤DNA的提取

2.3.2 Nested-PCR扩增AM真菌18S rDNA NS31/Glol区

2.3.3 DGGE凝胶的制备

2.3.4变性梯度凝胶电泳

2.3.5银染

2.3.6 DGGE条件优化

2.3.7 DGGE条带的序列分析

2.3.8 DGGE图谱分析

第3章结果与分析

3.1黄檗菌根发育状况

3.2黄檗根际土壤AM真菌的鉴定

3.2.1 AM真菌孢子形态特征

3.2.2 AM真菌25S rDNA D1/D2区序列分析

3.3黄檗菌根内AM真菌的分子检测

3.3.1 AM真菌种特异性引物的设计

3.3.2根样DNA的提取及AM真菌侵染根系检测

3.4菌群结构分析

3.4.1根际土壤DNA的提取

3.4.2 Nested-PCR

3.4.3 DGGE条件优化

3.4.4 DGGE条带的序列分析

3.4.5 DGGE图谱分析

第4章讨论

4.1课题背景

4.2 AM真菌孢子分离及DNA提取

4.2.1 AM真菌孢子分离

4.2.2 AM真菌单孢及根样DNA提取

4.3黄檗根际土壤AM真菌鉴定

4.4根际土壤总DNA的提取

4.5变性梯度凝胶电泳技术

4.5.1 PCR-DGGE分析

4.5.2 DGGE凝胶的制备

4.5.3 DGGE条件优化及银染

4.5.4 DGGE条带序列分析

4.5.5 DGGE图谱分析

第5章结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文