耐冷菌Pseudomonas sp.W7所产低温蛋白酶的酶谱分析及基因克隆

摘要

低温蛋白酶作用温度越低，催化效率越高，使其在工业和生活上得到了广泛的应用。但由于热不稳定性等限制条件，使得低温蛋白酶在应用方面受到了诸多限制。因此，越来越多的研究者们利用分子生物学技术及基因克隆等手段，通过异源表达来提高低温蛋白酶的产量，为低温蛋白酶的应用奠定了基础。
　　 本实验室筛选出来一株高产低温蛋白酶的耐冷菌Pseudomonassp.W7，经过前期酶学性质分析发现，该菌株所产的低温蛋白酶在35℃时拥有较高酶活，可达193.2U·mL-1。且温度超过40℃后，酶活力急剧下降。本实验采用了两种途径克隆耐冷菌Pseudomonassp.W7所产低温蛋白酶的基因序列。耐冷菌Pseudomonassp.W7经前期鉴定，确定属于假单胞菌属，我们首先依据NCBI数据库中假单胞菌属所产的胞外低温蛋白酶的同源保守区域序列设计引物，以耐冷菌Pseudomonassp.W7基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得低温蛋白酶的基因序列。另外，我们还从Pseudomonassp.W7所产低温蛋白酶出发，通过质谱分析获得了该酶匹配肽段氨基酸序列，并依此设计引物克隆到耐冷菌Pseudomonassp.W7所产低温蛋白酶的基因序列。我们将对两种方式得到的基因序列进行比对并进行了生物信息学分析。
　　 利用假单胞菌属所产的胞外低温蛋白酶的同源保守序列设计引物，以耐冷菌Pseudomonassp.W7基因组DNA为模板，PCR扩增出5'端长度为1238bp的序列和3'端长度为652bp的序列，拼接后找出完整的开放阅读框，其全长1719bp。该序列编码573个氨基酸，理论分子量为63639Da。通过NCBI比对发现该序列和PseudomonasfluorescensA506所产的C13家族的肽酶的同源性高达到99％。，而且由氨基酸的组成成分来看，该序列脯氨酸的含量低而甘氨酸的含量高，且丝氨酸、缬氨酸等小分子量氨基酸的含量也很高，这说明该蛋白序列符合低温酶的低温特性。通过生物信息学的分析，该序列上还含有4个N-糖基化位点，N端还有19个氨基酸残基的碎片，二级结构中α螺旋占22.95％，β折叠占19.01％。
　　 在15℃、20℃和25℃下分别培养耐冷菌Pseudomonassp.W7，对发酵液上清进行酶谱分析发现，该菌株在15℃下只产一种低温蛋白酶P1，酶活力为62.6U·mL-1，而在20℃和25℃下产两种低温蛋白酶P1和P2，酶活力为193.2U·mL-1和134.0U·mL-1。我们选择了酶活力较高的蛋白酶P2条带进行质谱鉴定，质谱结果由MASCOT检索比对得知，没有找到与低温蛋白酶完全匹配的蛋白，匹配率最高的蛋白的分数为84，推测该低温蛋白酶是一种新蛋白。与低温蛋白酶匹配度最高的蛋白为原肠胚锌指蛋白(RecName:Full=GastrulazincfingerproteinX1CGF28.1)。该蛋白由252个氨基酸组成，其中与目的蛋白酶有12个肽段匹配。
　　 利用匹配的肽段设计引物，以耐冷菌Pseudomonassp.W7基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得了长为1798bp的序列，分析后发现其中含有1238bp的5'端序列。同理设计引物，PCR扩增出3'端长为678bp的序列，将两段序列拼接并通过PCR验证得到完整的ORF，全长为1737bp的序列。该序列编码578个氨基酸，理论分子量为63821Da。对以上序列在NCBI中进行同源性比对分析发现，该序列与原肠胚锌指蛋白的同源性只有43％，结合质谱分析结果推测该低温蛋白酶是一种新蛋白。分析该序列的氨基酸组成发现，序列中甘氨酸含量很高，且一些小分子量氨基酸的含量也很高。这说明此蛋白序列具有低温酶的低温特性。通过生物信息学分析发现，该序列含有3个N-糖基化位点，但不合有信号肽序列，在二级结构中α螺旋占32.01％，β转角占7.44％。
　　 通过两种方法获得的两条低温蛋白酶基因序列经过比对，它们的同源性仅为15.03％，说明这完全是两条不同的蛋白，只是由于分子量相差很小，因此酶谱分析中并没有显示。结合生物信息学的分析及获得基因序列来看，初步推测耐冷菌Pseudomonassp.W7至少产两种低温蛋白酶，需要后续的功能验证来确认。

目录

摘要

第1章 绪论

1．1 低温酶的研究进展

1．1．1 低温酶的简介

1．1．2 低温酶的催化特性及其低温机制

1．1．3 低温酶的结构特征

1．2 低温蛋白酶的研究进展

1．2．1 蛋白酶的分类

1．2．2 低温蛋白酶的来源与种类

1．2．3 低温的蛋白酶酶学特征及结构特征

1．3 低温蛋白酶基因的克隆

1．3．1 基因克隆技术

1．3．2 通过分子手段获得蛋白酶基因的主要方法

1．3．3 国内外蛋白酶基因克隆的研究进展

1．4 课题研究的目的、意义及研究内容

1．4．1 课题研究的目的、意义

1．4．2 课题研究内容及实验思路

第2章 利用假单胞菌属所产低温蛋白酶的保守区序列进行基因克隆

2．1 试验材料

2．1．1 试验菌株

2．1．2 试验用药品及试剂

2．1．3 培养基

2．1．4 仪器和设备

2．2 试验方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 耐冷菌Pseudomonas sp．W7总DNA的提取

2．2．3 PCR扩增条件

2．2．4 目的条带回收

2．2．5 目的片段与载体的连接

2．2．6 CaCl2法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞

2．2．7 质粒DNA的转化

2．2．8 质粒的提取

2．2．9 重组质粒的PCR鉴定

2．2．10 测序及序列分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 基因组DNA的制备

2．3．2 PCR克隆低温蛋白酶5’端基因序列

2．3．3 PCR克隆蛋白酶基因的3’端基因序列

2．3．4 耐冷菌Pseudomonas sp．W7蛋白酶的基因克隆

2．3．5 生物信息学分析

2．4 本章小结

第3章 耐冷菌Pseudomonas sp．W7所产低温蛋白酶的酶谱分析

3．1 试验材料

3．1．1 试验菌株

3．1．2 试验用药品及试剂

3．1．3 培养基

3．1．4 仪器和设备

3．2 试验方法

3．2．1 耐冷菌Pseudomonas sp．W7产酶条件

3．3．2 耐冷菌Pseudomonas sp．W7所产低温蛋白酶酶谱分析

3．2．3 蛋白条带的胶内酶解

3．2．4 质谱分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 不同温度下Pseudomonas sp．W7所产低温蛋白酶酶谱分析

3．3．2 低温蛋白酶质谱分析

3．4 本章小结

第4章 质谱分析耐冷菌Pseudomonas sp．W7低温蛋白酶及其基因克隆

4．1 试验材料

4．1．1 试验菌株

4．1．2 试验用药品及试剂

4．1．3 培养基

4．1．4 仪器和设备

4．2 试验方法

4．2．1 引物设计

4．2．2 PCR扩增程序

4．3 结果与讨论

4．3．1 PCR克隆低温蛋白酶5’端基因序列

4．3．2 PCR克隆低温蛋白酶基因的3’端基因序列

4．3．3 PCR克隆低温蛋白酶基因序列

4．3．4 生物信息学分析

4．4 序列比对

4．5 本章小结

结论

展望

参考文献

致谢

声明