聚合抗虫基因cry2A*和cry1C*早粳稻分子检测和抗虫性评价

摘要

水稻是世界上最主要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米作为主食。虫害对水稻生产造成严重危害，每年因此而造成巨大的经济损失。苏云金芽胞杆菌(Bt)是一种革兰氏阳性菌，它能够产生对鳞翅目等昆虫具有特异毒性的晶体蛋白。为了防治鳞翅目昆虫，许多Bt基因已被成功的转入到水稻中，目前已获得许多具有抗虫特性的转基因水稻品系。本文以双价Bt抗虫水稻空育131和松粳9号作为研究对象，利用PCR、real timePCR、ELISA和Southern blot等方法，从DNA水平、mRNA水平、蛋白水平进行研究，从中选育出目的基因遗传稳定、拷贝数低且Bt蛋白表达量高、室内抗虫性效果显著的转基因水稻品系。
　　本研究主要内容包括：⑴利用根瘤农杆菌EHA105(pbar-cry2A*)和EHA105(pbar-cry1 C*)混合菌液介导，对水稻品种松粳9号进行遗传转化，获得含有cry2A*/cry1C*/bar基因的共转化植株;以空育131(cry2A*/bar)与空育131(cry1C*/bar)为亲本，通过有性杂交获得含有cry2A*/cry1 C*/bar基因的植株。利用Basta抗感性筛选、试纸条检测、PCR、Southern blot等方法，经过T0～T7代的筛选，成功获得了60个双价Bt抗虫水稻品系(cry2A*/cry1 C*/bar)，其中以空育131为亲本的10个，松粳9号为受体的50个。⑵实时荧光定量PCR与ELISA检测结果表明不同品系相同组织中Bt基因的转录水平存在差异;相同品系的不同组织中Bt基因的转录水平也存在明显差异;此外，在转录水平上cry2A*基因的转录水平明显高于cry1C*。酶联免疫吸附测定(ELISA)结果表明Bt蛋白的表达量与Bt基因的转录水平存在正相关性;相同品系不同组织中Bt蛋白含量由高到低依次为叶片＞幼穗＞茎鞘＞糙米。⑶室内抗虫性结果显示，Bt蛋白含量较高的品系对二化螟幼虫表现出较高的致死率。Southern blot结果表明，经过连续的传代之后，外源基因的遗传趋于稳定，且外源基因的拷贝数相对较低，多数品系介于1～2个，同时单拷贝品系表现出较稳定，较高的杀虫活性，这些培育而成的新材料对于品种选育具有重要的意义。⑷利用反向PCR方法对转基因品系中表现出较好抗虫能力且单拷贝的2-1品系中的cry2A*基因的侧翼序列进行扩增，通过NCBl数据库比对确定其位于第2号染色体上。

目录

摘要

第1章 引言

1．1 抗虫基因的来源及其作用机制

1．1．1 Bt基因

1．1．2 高等植物抗虫基因

1．2 转Bt基因水稻研究进展

1．2．1 转基因作物研究概况

1．2．2 转Bt基因水稻培育

1．3 转Bt基因作物抗性产生管理策略

1．3．1 低剂量接合生物天敌策略

1．3．2 转基因植物Bt毒素的组织或时空特异性表达

1．3．3 基因聚合策略

1．3．4 高剂量-庇护所策略

1．4 转基因检测技术研究进展

1．4．1 PCR检测技术

1．4．2 蛋白质检测方法

1．5 转基因植物T-DNA插入位点侧翼序列扩增方法

1．5．1 反向PCR

1．5．2 质粒拯救

1．5．3 PCR步移

1．5．4 热不对称交错PCR

1．6 研究目的与意义

第2章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 供试植物材料

2．1．2 植物表达载体

2．1．3 实验昆虫

2．1．4 实验试剂

2．1．5 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 Basta抗感性筛选

2．2．2 PCR检测

2．2．3 实时荧光定量PCR检测

2．2．4 水稻Bt蛋白测定

2．2．5 Southern blot检测

2．2．6 室内抗虫性鉴定

2．2．7 外源基因插入位点分析

第3章 结果与分析

3．1 转cry2A*／cry1C*基因水稻筛选

3．1．1 Basta抗感性检测

3．1．2 胶体金免疫层析及PCR检测

3．2 转cry2A*／cry1C*水稻目的基因表达量

3．2．1 mRNA表达量测定

3．2．2 Bt蛋白表达量测定

3．3 转cry2A*／cry1C*水稻目的基因拷贝数

3．4 转cry2A*／cry1C*基因水稻室内抗虫性鉴定

3．5 cry2A*基因插入位点

第4章 讨论

4．1 目的基因的筛选

4．2 Bt蛋白与水稻抗虫性分析

4．3 寒区超级早粳稻的培育

第5章 结论

参考文献

附录

致谢

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