农杆菌介导的RMPBA融合基因对花叶芋和百合的遗传转化研究

摘要

目前，室内环境甲醛污染问题日益严重，亟待解决。本研究利用基因工程手段，通过农杆菌介导法将外源甲醛代谢相关基因（rmpB和rmpA基因人工融合成 rmpBA基因）转入花卉植物中，以期改善植物吸收代谢甲醛的能力，提高其实用价值。主要研究内容如下：
　　1.百合组织培养体系的优化
　　以亚洲百合普瑞头的鳞片和叶片为外植体，研究了不同浓度激素组合的培养基对鳞片不定芽的诱导与分化、叶片愈伤组织的诱导与分化以及再生植株生根的影响。结果表明，鳞片不定芽诱导与分化最适培养基为MS+0.5 mg/L TDZ+0.2 mg/L NAA；诱导叶片愈伤组织的最适培养基为MS+0.5 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L KT+0.1 mg/L2,4-D；叶片愈伤组织分化的最适培养基为MS+0.1 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA；不定芽增殖的最理想培养基为MS+1.5 mg/L TDZ+0.2 mg/L NAA；百合植株生根效果最好的培养基为1/2MS+0.5 mg/L NAA。
　　2.农杆菌介导的rmpBA融合基因对花叶芋和百合的遗传转化
　　花叶芋遗传转化体系：以花叶芋叶片及叶柄为外植体，黑暗条件下，预培养3 d，农杆菌侵染8 min，共培养3 d，筛选时潮霉素浓度为5 mg/L，同时培养基中添加500 mg/L头孢霉素。愈伤组织形成后移到液体分化培养基中，筛选培养时继续用5 mg/L潮霉素。待抗性芽长出后，转入到含潮霉素5 mg/L的生根培养基中进行筛选培养。
　　百合遗传转化体系及其优化：探讨了预培养时间、侵染时间及添加NH4NO3和乙酰丁香酮（AS）对转化效率的影响。实验以百合鳞片和叶片为转化受体，于黑暗条件下，预培养3 d，农杆菌菌液浓度OD600为0.5时进行侵染，其中鳞片侵染12 min，叶片侵染8 min，侵染后共培养3 d。鳞片和叶片的潮霉素筛选浓度分别为90 mg/L和15 mg/L，并在后续培养基中均添加400 mg/L头孢霉素以抑制农杆菌的生长。抗性芽长出后转入生根培养基，潮霉素筛选浓度为80 mg/L。实验结果显示，共培养时不添加NH4NO3，预培养和侵染时添加乙酰丁香酮可提高转化效率。
　　3.抗性植株的分子检测
　　获得百合抗性植株26株，经PCR检测得到7株阳性植株，PCR阳性率为27％。获得花叶芋抗性植株20株，PCR检测抗性植株，其中6株为阳性植株，PCR阳性率为25%。
　　对获得的花叶芋和百合阳性植株目的基因表达情况进行RT-PCR和实时荧光定量PCR分析，结果表明人工改造的甲基营养菌rmpB和rmpA融合基因成功在花叶芋和百合中表达。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

第1章 绪论

1.1 甲醛的污染及其危害

1.2 百合的种类和应用价值

1.3百合组织培养研究进展

1.4百合基因工程研究进展

1.5本课题的研究背景、研究目的和意义

第2章 亚洲百合普瑞头组织培养体系的优化

2.1 引言

2.2 实验材料与方法

2.3 实验结果与分析

2.4讨论

2.5 本章小结

第3章 农杆菌介导的花叶芋遗传转化

3.1 引言

3.2 实验材料与方法

3.3 实验结果

3.4讨论

3.5 本章小结

第4章 农杆菌介导的百合遗传转化

4.1 引言

4.2 实验材料与方法

4.3 实验结果

4.4讨论

4.5 本章小结

第5章 转基因植株目的基因表达分析

5.1 引言

5.2 实验材料与方法

5.3 实验结果

5.4 讨论

5.5本章小结

结论

1. 亚洲百合普瑞头组织培养体系的优化

2. 建立了农杆菌介导的百合遗传转化体系

3. 获得了转rmpBA融合基因花叶芋和百合新株系

参考文献

攻读硕士学位期间所发表的学术论文

声明

致谢