内切葡聚糖酶基因在运动发酵单胞菌中的整合与表达

摘要

本论文以Z.mobilis的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增得到Z.mobilis的乙醇脱氢酶基因(adhⅡ)的强启动子区和终止子区.为了使来自绿色木霉的葡聚糖内切酶基因EgⅢ的cDNA能够在Z. mobilis的adhⅡ的强启动子控制下得到高效表达,利用重叠延伸剪接技术将EgⅢ的cDNA融合于该启动子和终止子之间,构建得到了针对Z. mobilis的整合型质粒pPEgTP,并利用电穿孔转化法将该重组质粒转入到Z. mobilis中.通过乙醛指示平板的显色反应并经PCR和测序鉴定筛选得到阳性重组菌株.论文的研究利用重叠延伸剪接技术成功地将来自绿色木霉的纤维素酶基因cDNA整合到了运动发酵单胞菌的基因组,在不需要选择压和诱导物存在的前提下得到了高效的表达,为对运动发酵单胞菌的遗传改造以扩大其可利用碳源范围提供了新的思路和方法.

目录

文摘

英文文摘

第1章绪论

1.1课题背景

1.2国内外研究现状及分析

1.2.1纤维素科学的研究进展

1.2.2纤维素酶的研究进展

1.3运动发酵单胞菌研究现状

第2章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1载体和菌株

2.1.2主要试剂

2.1.3仪器设备

2.2实验方法

2.2.1重要缓冲液及常用试剂的配制

2.2.2培养基的配制

2.2.3运动发酵单胞菌冻干菌的复苏培养

2.2.4菌液的保藏

2.2.5运动发酵单胞菌基因组DNA的提取

2.2.6引物设计和PCR扩增

2.2.7重叠延伸剪接技术

2.2.8高效感受态细胞的制备

2.2.9质粒转化大肠杆菌

2.2.10电穿孔转化

2.2.11质粒DNA的小量制备——碱裂解法

2.2.12苯酚/氯仿抽提及乙醇沉淀

2.2.13 DNA片段的凝胶回收

2.2.14 DNA的纯化、浓缩

2.2.15 DNA的酶切与连接

2.2.16阳性克隆的鉴定与筛选

2.2.17纤维素酶活力测定

2.3本章小结

第3章结果与分析

3.1重组质粒的构建

3.1.1adhII基因及其启动子、终止子的克隆

3.1.2重叠延伸反应

3.1.3目的片段构建到pUC19载体

3.1.4重组质粒pPEgTP的构建

3.1.5重组质粒的序列测定

3.2目的基因的转化及转化子鉴定

3.3重组子的酶活分析

3.3.1标准曲线

3.3.2 CMC酶活力测定

3.4本章小结

第4章讨论

4.1引物设计

4.2 PCR反应的保真性

4.3 SOE-PCR

4.4整合型表达

4.5展望

结论

参考文献

附录1

附录2

攻读学位期间发表的学术论文

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致谢