纤维素降解细菌新种的酶学特性及基因组文库构建策略

摘要

当前，随着全球人口的增长及对不可再生资源的大量消耗，资源利用危机已经显露端倪。纤维素物质作为自然界中最为丰富的有机物质及可再生资源，因其具有充足的供应及低廉的价格，所以对其进行大规模的转化利用有着非常诱人的前景。然而，由于其具有高结晶的抗性构造，所以要把它水解成可利用的小分子单糖相当困难，因此直到目前为止纤维素物质仍没有得到非常广泛的转化利用。所以，当前针对纤维素物质资源的转化利用研究，已经在全世界范围内引起了高度的重视。
　　本文针对纤维素物质利用过程中所关注的热点问题，以纤维素降解细菌为研究对象，分别从纤维素降解微生物资源的开发、纤维素酶学特性分析以及菌株的基因组文库构建等角度进行了研究和论述。首先，利用梯度稀释法及平板画线纯化法分离到一株具有表达纤维素酶能力的细菌菌株，基于1440bp的16SrDNA序列比对分析后发现，分离菌株与Vibrioscophthalmi的亲源关系较为接近，其序列同源率为97.92％，表明菌株应为纤维弧菌属内的一个成员。在16S-23SrDNA间隔区（ISRs）序列中存在保守的tRNAala和tRNAile基因编码区，而在可变区中不具有同源序列，基因组中的G+Cmol％含量为53.07mol%，略高于弧菌属内的其它典型菌株。另外，菌株与其它高同源性及相近生理特性细菌之间在生理特性上也存在一些明显的差异。多项分类鉴定结果表明，所分离菌株在系统进化发育上应该是有别于弧菌属内其它典型细菌的一个新类型菌株。
　　菌株所表达的纤维素酶系统为诱导酶，其中包括CMCase、EG及BGL三种酶蛋白成分，其酶蛋白量在酶系中的比例接近3.1:1.4:1.0。纤维素酶系统发挥活性的最适pH为5.0至5.5，最适温度为50℃。Zn2+、Fe2+及Ca2+对于纤维素酶系统的活性有明显的促进作用，而Fe3+与Hg2+对于酶系统活性有非常强烈的抑制作用。菌株采用了不同的代谢机制完成对纤维素物质和可溶性糖的代谢。菌株以滤纸纤维素作为碳源的发酵过程中，体系中的还原糖量在初始阶段积累增加，但是随着代谢的进行还原糖量开始迅速降低，反应结束后体系中的还原糖量变得极其微少。酶系统中的羧甲基纤维素酶和滤纸纤维素酶组分主要定位在细胞外膜。
　　此外，分别采用四碱基位点识别限制酶Sau3AI和六碱基位点识别限制酶PstI作为工具酶，构建了菌株的Sau3AI和PstI双基因组文库。菌株高浓度基因组样品的制备、重组体构建过程中DNA片段的最佳连接比例及宿主菌株对重组体所具有的高感受能力为基因组文库的完整性构建奠定了坚实的基础。对双文库中随机挑取克隆子中的重组质粒进行酶切的结果显示，双文库中的重组体中都含有长度不等的外源基因片段，具备完整基因组文库应包含核酸序列片段多样性的要求。此外，双文库中的克隆子数目，符合L.Clarke和J.Carbon所提出的计算一个完整基因组文库所应该包含有实际克隆数的理论数值要求。

目录

纤维素降解细菌新种的酶学特性及基因组文库构建策略

CELLULASE CHARACTERISTICS AND GENOME LIBRARIS CONSTRUCTION OF A STRAIN OF NOVEL CELLULOLYTIC BACTERIUM

摘要

Abstract

第1章 绪论

1.1 纤维素物质的结构特征及降解利用

1.1.1 纤维素生物质的结构组成

1.1.2 纤维素生物质的降解利用

1.2 纤溶性微生物种类的多样性

1.2.1 纤维素降解性真菌类群

1.2.2 纤维素降解性细菌类群

1.3 微生物纤维素酶系统的构成及特征

1.3.1 微生物纤维素酶系统的构成

1.3.2 纤维素酶组分的结构域特征

1.4 微生物纤维素酶系统的作用形式

1.4.1 微生物的非复合型纤维素酶系统

1.4.2 微生物的复合型纤维素酶系统

1.4.3 纤维小体基因的复制重排与同源转移

1.5 微生物对纤维素物质的降解机制

1.5.1 纤维素酶系统对纤维素水解的作用机理

1.5.2 纤维素酶系统中经典组分间的协同作用

1.5.3 纤维素降解过程中纤维二糖脱氢酶的作用

1.5.4 其它蛋白因子在纤维素降解过程的作用

1.6 课题来源及研究的目的意义和内容

1.6.1 课题来源

1.6.2 本课题研究的目的意义及内容

第2章 实验材料与方法

2.1实验仪器和试剂

2.2细菌来源及分离培养

2.2.1细菌菌株的来源

2.2.2细菌菌株的分离培养

2.3细菌的表型及生理特征鉴定

2.3.1 菌株的显微成像样品制备

2.3.2 菌株的生理生化特性鉴定

2.4应用分子生物学手段对菌株的鉴定

2.4.1 分子克隆实验操作培养基

2.4.2 菌株的16S rDNA基因的克隆测序

2.4.3 菌株16S-23S rDNA间隔区（ISRs）的克隆测序

2.4.4 菌株基因组中G+C mol%的含量测定

2.5菌株的纤维素酶学特性分析

2.5.1 菌株的纤维降解能力鉴定

2.5.2 不同细胞组分的制备及酶活力测定

2.5.3 温度及pH对纤维素酶活力的影响

2.5.4 金属离子对纤维素酶活力的影响

2.5.5 不同底物对纤维素酶活力的影响

第3章 具纤溶性细菌Vibrio sp. N-1的系统进化分析

3.1具纤溶性菌株N-1的分离纯化

3.2菌株N-1的形态学特征

3.3菌株N-1的生理生化特性

3.4 菌株N-1的16S rRNA基因克隆和测序

3.4.1 菌株N-1的基因组DNA的提取

3.4.2 16S rDNA 基因序列的PCR扩增

3.4.3 菌株16S rDNA 基因的部分序列

3.5菌株N-1的16S-23S rRNA ISRs序列

3.6菌株N-1的G+Cmol %含量

3.7菌株的系统发育进化特征

3.8 本章小结

第4章 细菌Vibrio sp. N-1纤维素酶系统的酶学特性

4.1菌株纤维素酶系统的纤维降解能力

4.2菌株纤维素酶系统的单酶成分分析

4.3 pH对菌株纤维素酶系统活性的影响

4.3.1 菌株纤维素酶系统的最适pH值

4.3.2 菌株纤维素酶系统的pH稳定性

4.4温度对菌株纤维素酶系统活性的影响

4.4.1 菌株纤维素酶系统的最适温度

4.4.2 酶系统在不同温度下的稳定性

4.5金属离子对纤维素酶系的活性影响

4.6不同的发酵底物对酶系的活性影响

4.7菌株纤维素酶系统的诱导型特征

4.8菌株表达纤维素酶的细胞定位

4.8.1 菌株表达CMCase的细胞定位

4.8.2 菌株表达FPase的细胞定位

4.9 本章小结

第5章 细菌Vibrio sp. N-1基因组文库的构建策略

5.1菌株双基因组文库的构建与评估程序

5.2菌株N-1高浓度基因组DNA的制备

5.3菌株Sau 3A I基因组文库的构建策略

5.3.1 菌株基因组的Sau 3A I部分酶切

5.3.2 载体PUC19的Bam H I完全酶切

5.3.3 载体PUC19的Bam H I完全酶切后去磷酸化

5.3.4 Sau 3A I酶切的基因组片段与载体重组

5.3.5 Sau 3A I文库中重组转化子的筛选与鉴定

5.4菌株Pst I基因组文库的构建策略

5.4.1 菌株基因组的Pst I部分酶切

5.4.2 载体PUC19的Pst I完全酶切

5.4.3 载体PUC19的Pst I完全酶切后去磷酸化

5.4.4 Pst I酶切的基因组片段与载体重组

5.4.5 Pst I文库中重组转化子的筛选与鉴定

5.5菌株双基因组文库构建完整性评估

5.6本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

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致谢