应用RNAi技术研究LRP1B基因与肿瘤转移的相关性

摘要

低密度脂蛋白受体相关蛋白1B(low density lipoprotein receptor-related protein1B，LRP1B)是低密度脂蛋白受体家族的成员。已有研究发现，LRP1B基因在许多人类肿瘤组织中失活，提示该基因是一个潜在的肿瘤抑制基因。进一步研究发现，LRP1B可调节uPA系统相关分子的代谢，而uPA系统与肿瘤细胞的侵袭与转移密切相关。因此，为阐明LRP1B基因与肿瘤转移的相关性，本研究以HEK293细胞为材料应用RNAi技术特异地封闭LRP1B基因的表达，通过检测HEK293细胞生物学表型的变化来评价LRP1B基因作为候选的肿瘤抑制基因与肿瘤转移的相关性。
　　LRP1B基因是一个转录本长达16.5kb的大转录本基因。根据高效siRNA序列特征和靶序列处的mRNA二级结构特点，本研究对LRP1B基因多达1100个的siRNA候选靶序列进行双重评价，最终在基因转录本的不同位置选取了6个siRNA靶位点。针对这些靶位点，本实验构建了6个表达shRNA的pSilencer4.1重组体，稳定转染HEK293细胞并采用半定量RT-PCR检测各重组体的沉默效果。结果表明，本实验所构建的6个shRNA重组体中有5个对LRP1B基因形成了有效沉默（＞50％），并得到了多个完全封闭LRP1B基因表达的HEK293细胞单克隆。这为后续的HEK293细胞的生物表型分析提供了理想的材料。
　　本研究通过绘制细胞生长曲线和软琼脂集落形成实验研究了LRP1B基因沉默后HEK293细胞生长特性的改变。结果发现，虽然封闭LRP1B基因的表达后HEK293细胞的生长曲线并未发生明显变化，但在软琼脂中形成的集落却有明显变大、增多的趋势，说明LRP1B具有抑制HEK293细胞非锚定依赖性生长的功能。本研究又通过Transwell侵袭小室实验、细胞趋化性实验研究了HEK293细胞侵袭和趋化性运动能力的改变。结果发现，封闭LRP1B基因的表达增强了HEK293细胞的侵袭和趋化性运动能力，并且增强的程度与LRP1B的基因表达封闭水平呈正相关。这说明，LRP1B基因具有抑制HEK293细胞侵袭与转移的功能。总之，通过本研究表明，LRP1B基因作为一个候选肿瘤抑制基因具有抑制肿瘤细胞恶性转化和转移的功能。

目录

应用RNAi 技术研究LRP1B 基因与肿瘤转移的相关性

应用RNAi 技术研究LRP1B 基因与肿瘤转移的相关性

THE STUDY ON THE RELATION OFLRP1B WITH TUMOR METASTASISBY RNAi METHOD

摘 要

Abstract

第1章 绪论

1.1 LRP1B 基因概述

1.2 RNAi 技术

1.3 本课题的研究目的及意义

第2章 人LRP1B 基因siRNA 设计与重组体构建

2.1 实验材料

2.2 siRNA 打分软件─siRNA Score 的设计

2.3 siRNA 序列设计

2.4 shRNA 重组体的构建和验证

2.5 针对大转录本基因的siRNA 设计策略

2.6 本章小结

第3章 shRNA 重组体的稳定转染及单克隆的筛选

3.1 实验材料

3.2 HEK 293 细胞中LRP1B 基因表达分析

3.3 shRNA 重组体的稳定转染

3.4 单克隆细胞株的筛选

3.5 半定量RT-PCR 检测各单克隆细胞株的基因沉默效果

3.6 讨论

3.7 本章小结

第4章 LRP1B 基因沉默后HEK 293 细胞增殖、侵袭及趋化性运动能力等表型的变化

4.1 实验材料

4.2 LRP1B 基因沉默后HEK 293 细胞生长能力的改变

4.3 LRP1B 基因沉默后HEK 293 细胞转移能力的改变

4.4 讨论

4.5 本章小结

结论

参考文献

附录1 软琼脂集落形成实验SPSS 软件分析数据

附录2 侵袭小室实验SPSS 软件分析数据

附录3 细胞趋化性运动实验SPSS 软件分析数据

攻读学位期间发表的学术论文

哈尔滨工业大学硕士学位论文原创性声明

哈尔滨工业大学硕士学位论文使用授权书

哈尔滨工业大学硕士学位涉密论文管理

致谢