油田回注水系统硫酸盐还原菌特征及其活性生态调控研究

摘要

大庆油田回注水系统中硫酸盐还原菌（SRB）大量繁殖，产生的硫化物导致设备腐蚀、垮电场等，给油田生产带来严重的危害和巨大的经济损失。如何有效地系统控制硫酸盐还原菌的繁殖，减少其对油田生产带来的危害，制定合理地控制方案，是油田生产亟待解决的问题。生态调控是以往生物抑制策略的延续和改进，强调整体效能、系统健康和持续控制。笔者提出SRB菌活性的生态调控方法，改变了以往单纯追求以杀灭SRB数量为目的的传统思维模式，转变以抑制SRB菌活性为目的研究思路，是大庆油田系统控制SRB菌危害观念的变革和方法的创新。针对硫酸盐还原菌相关的理论和基础性的研究，有利于填补和深入油田硫酸盐还原菌研究领域的空白。
　　课题围绕SRB菌活性的生态调控为主线，旨在开发出新型的绿色净水剂—硫酸盐还原菌生态抑菌剂和抑菌填料，提出对整个回注水系统的生态调控技术和策略。主要采用微生物分子生态学、微生物蛋白组学，环境工程，环境友好材料等学科的研究方法和手段，以应用为主，注重理论研究，理论和实践相结合解决油田生产中的一些实际的问题。
　　研究发现油田污水反硝化能力与硫酸盐还原能力的相对水平仅为0.038～0.38，其反硝化能力极弱；对两个代表性的油田回注水系统，微生物群落空间演替的系统轨迹分析表明，大庆油田回注水系统中群落比较新颖；硫酸盐还原菌种群及硫化物分布规律表明，硫酸盐还原菌主要有11个属、反硝化细菌有7个属，有些细菌兼有硫酸盐还原和反硝化能力，SRB菌分布于整个回注水工艺系统，在联合站开始大量繁殖，其主要来源于回注水系统，硫化物的分布规律与其相同。
　　微生物分子生态学技术结合纯培养技术及工艺特征研究发现，硫酸还原菌种群比较新颖，存在新种的可能性很大。传统上认为造成回注水系统的硫化物的产生和腐蚀是由δ-变形菌门的Desulfovibrio等组成，其只占种群极少的部分（<1％），油田回注水系统中SRB极少部分来源于地层油井采出液中，绝大部分是具有硫酸盐还原功能的菌株，大量的SRB菌是在回注水系统中大量繁殖产生的。研究证实，造成严重危害的是具有硫酸盐还原功能的微生物。该发现有利于解释系统硫化物的成因，为硫酸盐还原菌活性生态调控提供理论上的依据。
　　将硫酸盐还原菌分为：附着型SRB菌和非附型SRB菌。该发现重要的意义在于，控制回注水系统SRB繁殖以及由此带来的危害，既要杀灭流动相中的SRB菌，同时也要杀灭管壁、罐壁附着型SRB菌。
　　纯培养技术分离到DesulfovibriodesulfuricansstrainF8，克隆获得Dsr基因全序列长度为2740bp，序列包含三个ORFs，即dsrA、dsrB、dsrD三个亚基，Aps基因的序列长度为2799bp，包含两个ORFs，即apsB、apsA两个亚基。分离获得两株新菌，大庆杆菌-MF（EnterobacterDaqingsp.nov.）以聚丙烯酰胺为唯一碳源，聚合物降解率为50.67%，保藏号为CGMCCNo.1910；大庆杆菌-WL（ClostridiumDaqingsp.nov.）聚合物降解率为52%，保藏号为CGMCCNo.1911。
　　在国内首次对附着型硫酸盐还原菌进行检测研究，通过在管壁和罐壁上安装改良后罗氏检测装置，与开发出非附型SRB检测方法相结合，实现附着型SRB菌定量检测，同时证明附着型SRB大量存在；基于纯培养技术开发出一整套“厌氧全过程的倍比稀释纯培养记数工艺”，检测周期由14d缩短到3d；开发出基于特定基因的MPN法对SRB菌和DNB菌进行定量检测的方法，适合于应用常规的PCR仪进行扩增，直接通过琼脂糖电泳实现细菌的定量检测。该检测方法的前提是开发一种《直接用于PCR扩增的“菌液制备”》的方法，不用提取DNA可以直接进行PCR扩增，针对SRB菌目标基因开发出DSR-MPN-PCR法、APS-MPN-PCR法及16SrDNA-MPN-PCR法；反硝化细菌开发出16SrDNA-MPN-PCR法和nirS-MPN-PCR法，检测周期需要3～4h，降低了检测费用，提高检测精度约100倍。采用TaqMan-MGB、TaqMan-LNA型探针，建立新型硫酸盐还原菌和反硝化细菌的DNA荧光定量PCR检测系统。根据硫酸盐还原菌的16SrDNA序列、APS基因、DSR基因设计的特异性探针。反硝化细菌基于16SrDNA基因设计的荧光探针，检测精度提高两个数量级，样本DNA提取到荧光定量PCR最后获得检测结果仅需要6h。
　　采用纳米/亚微米电气石，制备出电气石载纳米氧化锌、电气石载铜、电气石载钼、电气石载锰硫酸盐还原菌无机抑菌粉剂，有效地抑制SRB菌的活性，提高ORP，不产生硫化物。开发出一种新型抑菌陶粒作为固定化填料，XPS能谱主要成分分别为Si2p为11.17%，Mo3d为3.12%，Zn2p3为3.47%，Mn2p为2.86%，Cu2p为2.35%。陶粒的密度为1.4-3.5g/cm3，抗压强度>5.2MPa，60h后ORP稳定在6.1mV，陶粒的投加只是抑制SRB菌的活性，对反硝化细菌对NO3-的利用和COD去除基本上无影响。
　　生态调控的关键生态因子：随S/N值的减小，反硝化抑制硫酸盐还原的效果越明显，并且反硝化完成后，硫酸盐还原恢复阶段硫化物的产生速率也随之减小。乙酸、乙醇和乳酸是适于DNB生长的碳源，乳酸同时适于SRB生长。COD含量影响抑制效果，随COD的相对含量降低，DNB和SRB对基质的竞争越激烈，抑制效果越好。钼酸盐能有效的抑制SRB的活性，钼酸盐和硝酸盐协同作用效果明显。
　　生态调控机理的验证和新理论的发现：验证存在三种调控机理，即DNB和SRB对基质的竞争、反硝化中间产物的抑制作用和自养硝酸盐还原菌的氧化作用。同时发现和验证了一个新的理论—反硝化细菌底物选择作用，该理论定义为从生物本身而言，存在着同时反硝化和硫酸盐还原细菌，该类菌群能同时和分别利用硫酸根和硝酸根，在不同的工艺条件下，不同的底物下，进行着不同的代谢，该理论的提出可以有效地对其他理论进行解释。
　　生态调控以硝酸盐为主进行反硝化抑制，SO42-/NO3-比和碳源（COD）的调控是影响抑制效果最重要生态因子。SO42-/NO3-为1:1时，出水中未检测到硫离子，抑制率近100％；氧化还原电位能够反映出系统中反硝化抑制硫酸盐还原作用效果，氧化还原电位在-50mV～-150mV时，主要发生反硝化作用，氧化还原电位在-300mV～-400mV时，主要发生硫酸盐还原反应。采出水抑制后，硫化物浓度可由2.5mg/L降低至0.3mg/L以下。
　　研制出硫酸盐还原菌生态抑菌剂，以硝酸盐为主，同时含有一定量其它辅助成分，不使油田水的性质发生改变，加药成本为0.20元/m3污水。
　　连续流试验研究了生态抑菌剂和抑菌陶粒对常规采出水和含聚污水抑制率达到100％，出水中未检测到硫化物的存在。抑菌陶粒和抑菌剂联合使用抑制SRB效果与单独使用抑菌剂相比更加稳定和持久，具体选择的方式需要根据生产实际情况而定。
　　油田回注水系统硫酸盐还原菌生态调控，分为两个层面，宏观生态调控和微生态调控的整合，宏观生态调控方法是全面监测，清除系统内的硫化物和处理系统内附着细菌，然后进行有效的控制和调控。微生态调控通过生态抑菌剂，调整系统中的微生物群落的功能和生态位，抑菌剂注入速度依据抑制剂母液浓度、管道水中硫酸根浓度和水流量确定；油田回注水系统处理站根据抑制目的可选择单一调控方案，也可以选择两种组合调控方案。

目录

油田回注水系统硫酸盐还原菌特征及其活性生态调控研究博士研究生：魏利导师：马放教授申请学位：工学博士学科、专业：环境工程所在单位：市政环境工程学院答辩日期：2008 年6 月授予学位单位：哈尔滨工业大学

THE CHARACTERS OF SULFATE REDUCING BACTERIA AND ECOLOGICAL INHABITATION TO THEIR ACTIVITY IN THE INJECTION WATER SYSTEM OF DAQING OILFIELD

摘要

Abstract

第1章绪论

1.1课题背景

1.1.1课题来源

1.1.2油田硫酸盐还原菌研究中存在的问题

1.2硫酸盐还原菌系统发育和生态学研究

1.2.1硫酸盐还原菌的系统发育地位

1.2.2硫酸盐还原菌的生理生态学

1.2.3硫酸盐还原菌的代谢途径和酶学研究

1.3油田微生物分子生态学和蛋白组学研究进展

1.3.1微生物分子生态学研究方法

1.3.2微生物蛋白质组学表达谱研究

1.4油田硫酸盐还原菌的危害

1.4.1对油田开采的影响

1.4.2硫酸盐还原菌的腐蚀机理

1.4.3无机抑菌粉剂和抑菌填料

1.5生态调控的原则和方法

1.5.1生态调控应遵循的基本原则

1.5.2微生物控制SRB的机理

1.5.3新型硝酸盐基处理技术

1.6反硝化控制SRB的研究现状

1.6.1反硝化细菌DNB的研究进展

1.6.2反硝化细菌对硫酸盐还原菌的抑制

1.6.3基质竞争性抑制作用

1.6.4反硝化中间产物抑制理论

1.6.5反应系统内部形成厌氧硫循环的观点

1.6.6电位控制观点

1.6.7反硝化控制SRB的应用实例

1.7研究目的和意义及主要研究内容

1.7.1研究目的与意义

1.7.2研究内容

第2章试验材料与方法

2.1主要仪器设备和实验材料

2.1.1主要的试验材料

2.1.2主要的仪器和设备

2.2微生物分子生态学和蛋白组学试验方法

2.2.1基因文库的构建和分析方法

2.2.2PCR-DGGE的电泳图谱的优化

2.2.3硫酸盐还原菌全蛋白表达谱和表达谱差异研究

2.3大庆油田回注水系统水质特征

2.3.1大庆油田地面水处理站硫化物含量分布状况

2.3.2大庆油田典型水处理站水质特征

2.3.3回注水系统中硫酸盐还原菌和硫化物测试点的选择

2.4硫酸盐还原菌分离纯化

2.4.1分离介质类型和采样地点

2.4.2分离筛选的方法

2.4.3硫酸盐还原菌的分离纯化

2.5硫酸盐还原菌和反硝化细菌的定量检测

2.5.1基于特定基因的MPN-PCR法的试验方法

2.5.2实时荧光定量PCR对SRB菌和DNB菌的定量检测

2.6新型无机抑菌粉剂和抑菌陶粒的制备及表征

2.6.1纳米/微米电气石的测试和表征

2.6.2纳米氧化锌的制备和表征

2.6.3电气石载纳米氧化锌无机抑菌粉剂的制备和表征

2.6.4电气石载铜无机抑菌粉剂的制备和表征

2.6.5电气石载钼无机抑菌粉剂的制备和表征

2.6.6电气石载锰无机粉剂的制备和表征

2.6.7新型抑菌陶粒制备及其硫酸盐还原菌抑菌效能

2.7生态调控硫酸盐还原的关键生态因子

2.7.1间歇试验条件选择

2.7.2间歇试验步骤

2.8生态调控硫酸盐还原菌活性的连续硫试验设计方法

2.8.1反硝化作用抑制硫酸盐还原生态调控连续流试验设计方法

2.8.2反硝化作用抑制硫酸盐还原生态调控现场水试验设计

2.8.3生态抑菌剂和抑菌陶粒联合抑制室内连续流试验

2.8.4联合抑制现场水连续流试验

第3章回注水系统硫酸盐还原菌种群组成及生态分布规律

3.1大庆油田回注水系统SRB分布规律和来源分析

3.1.1常规水驱处理站系统SRB分布规律

3.1.2聚驱处理站系统SRB分布规律

3.1.3两个系统中H2S含量测试结果及分析

3.1.4两系统总铁、腐蚀速率测试结果及分析

3.1.5回注水系统中硫化物分布规律和成因分析

3.1.6油田回注水系统SRB来源分析

3.2PCR-DGGE条件优化

3.2.1不同16SrDNA靶序列对DGGE分析的影响

3.2.2时间进程法对电泳时间和电泳条件的优化

3.3常规水驱地面工艺系统微生物组成及优势种群分析

3.3.1常规水驱采出液中16SrRNA克隆文库种群组成分析

3.3.2常规水驱地面工艺系统流动相微生物种群组成及动态演替分析

3.3.3基于腺苷酸还原酶基因（APS）文库的SRB种群的组成

3.4聚合物驱油地面工艺系统微生物组成及优势种群分析

3.4.1聚合物驱油采出液的16SrRNA基因克隆文库种群组成分析

3.4.2电脱水器电附着物微生物组成以及优势菌种分析

3.4.3注聚工艺生物膜微生物组成及以演替分析

3.4.4聚驱地面工艺系统流动相微生物种群组成及动态演替分析

3.5大庆油田回注水系统中SRB和DNB种属

3.5.1GenBank中注册的具有硫酸盐还原功能的微生物

3.5.2GenBank中具有反硝化功能的微生物种属

3.5.3基于16SrDNA文库的反硝化细菌微生物组成研究

3.6本章小结

第4章硫酸盐还原菌的系统进化地位及新种特性

4.1硫酸盐还原菌的系统发育分析及形态特征

4.1.1附着型和非附着型硫酸盐还原菌的发现

4.1.2优势SRB菌的形态特征和系统发育分析

4.2DesulfovibriodesulfuricansstrainF8特征描述及基因克隆

4.2.1模式菌株的形态和生理生化特征以及脂肪酸分析

4.2.216SrDNA序列系统发育学分析

4.2.3Dsr基因的克隆和序列同源性分析

4.2.4Dsr基因的开放阅读框和功能分析

4.2.5aps基因的克隆和序列同源性分析

4.2.6aps基因的开放阅读框和功能分析

4.2.7模式菌株的聚合物降解生物降解特性

4.3模式菌株的全蛋白组表达谱研究

4.4大庆杆菌-MF（EnterobacterDaqingsp.nov.）新种的特征及其生物降

4.4.1种名来源EnterobacterDaqingsp.nov.(fromDaqi

4.4.2MF菌株聚合物降解生物降解

4.5大庆杆菌-WL（ClostridiumDaqingsp.nov.）新菌的特征及其生物降解

4.5.1种名来源ClostridiumDaqingsp.nov.(fromDaqin

4.5.2WL菌株生物降解特性

4.6SRB菌的生理生态因子

4.7本章小结

第5章硫酸盐还原菌和反硝化细菌快速定量检测方法的建立

5.1管壁和罐壁附着型SRB定量检测

5.1.1附着型SRB检测装置

5.1.2管壁和罐壁附着SRB定量检测

5.2厌氧全过程的倍比稀释纯培养记数工艺

5.2.1厌氧培养基配制的装置的改进

5.2.2用于倍比稀释的厌氧无菌水的配制

5.2.3厌氧SRB菌培养基改良和加药方法改进

5.2.4采用摇床培养缩短培养时间

5.2.5实现3天初步记数4天稳定记数

5.2.6标准培养基与改良的培养基的比较分析

5.3MPN-PCR法对硫酸盐还原菌和反硝化细菌的定量检测

5.3.1直接用于PCR扩增的“菌液制备”

5.3.2DSR-MPN-PCR法对硫酸盐还原菌的定量检测

5.3.3APS-MPN-PCR法对硫酸盐还原菌的快速定量检测研究

5.3.416SrDNA-MPN-PCR法对SRB菌的快速定量检测研究

5.3.516SrDNA-MPN-PCR法对反硝化细菌的快速定量检测研究

5.3.6nirS-MPN-PCR法对反硝化细菌的快速定量检测研究

5.4基于realtime-PCR实时定量检测研究

5.4.1基于16SrDNA基因序列硫酸盐功能菌的荧光定量检测方法

5.4.2基于腺苷酸还原酶基因(APS)的SRB菌的定量检测方法

5.4.3基于异化型亚硫酸盐还原酶（DSR）基因的SRB菌的荧光定量检测方法

5.4.4基于16SrDNA基因反硝化细菌的荧光定量检测方法

5.5本章小结

第6章生态调控硫酸盐还原菌活性关键生态因子及其抑制机理

6.1油田采出水中微生物反硝化和硫酸盐还原能力分析

6.1.1微生物的反硝化作用机理及影响因素

6.1.2油田采出水中微生物的硝酸盐还原与硫酸盐还原相对能力

6.2生态调控硫酸盐还原的关键生态因子

6.2.1S/N比对抑制效果的影响

6.2.2污泥预培养对抑制效果的影响

6.2.3COD对抑制效果的影响

6.2.4碳源种类对抑制效果的影响

6.2.5碱度对抑制效果的影响

6.2.6钼酸盐和硝酸盐协同抑制效果的影响

6.3生态调控硫酸盐还原菌机理验证

6.3.1DNB和SRB对基质的竞争作用

6.3.2反硝化中间产物抑制作用

6.3.3自养硝酸盐还原菌的氧化作用

6.4反硝化细菌底物选择作用——新理论的提出

6.4.1同时反硝化和硫酸盐还原功能菌株的分离和功能验证

6.4.2反硝化细菌的的系统发育分析及功能验证

6.4.3反硝化细菌底物选择作用理论的阐述

6.5本章小结

第7章油田回注水系统硫酸盐还原菌活性生态调控研究

7.1反硝化抑制SRB菌活性生态调控及种群动态演替研究

7.1.1反应器启动

7.1.2试验运行生态调控过程

7.1.3反硝化抑制效果影响因素

7.1.4微生物群落动态演替和优势反硝化微生物种群

7.2原水反硝化抑制试验效果

7.2.1常规水驱采出液抑制试验效果及群落动态演替研究

7.2.2含聚采出水抑制试验效果和群落动态演替研究

7.3硫酸盐还原菌生态抑菌剂的研制

7.4生态抑菌剂和抑菌陶粒联合抑制室内连续流试验

7.4.1试验运行参数调控过程

7.4.2硫酸盐还原菌反应器培养启动阶段

7.4.3生态抑菌剂抑制硫酸盐还原菌阶段SO42-和NO3-的变化

7.4.4抑菌陶粒抑制硫酸盐还原菌阶段

7.4.5生态抑菌剂和抑菌陶粒联合抑制硫酸盐还原菌阶段

7.4.6降COD抑制硫酸盐还原菌阶段

7.5联合抑制硫酸盐还原菌活性现场水抑制效果

7.5.1普通含油污水处理效果研究

7.5.2含聚污水处理效果研究

7.6回注水系统SRB活性生态抑制调控策略及技术经济分析

7.6.1油田细菌控制方法和技术评价

7.6.2油田回注水系统细菌控制技术优化研究

7.6.3硫酸盐还原菌活性生态抑制适应的投药点

7.6.4硫酸盐还原菌活性生态抑制剂加药方法和加药原则

7.6.5油田回注水系统硫酸盐还原菌生态抑制方案

7.6.6硫酸盐还原菌活性生态抑制剂成本分析及技术经济分析

7.7本章小结

结论

参考文献

附录

附录Ⅰ新型抑菌剂和抑菌陶粒表征及抑菌效能

Ⅰ-1纳米/微米电气石测试表征

Ⅰ-2纳米氧化锌的表征

Ⅰ-3电气石载纳米氧化锌的表征

Ⅰ-4电气石载铜的表征

Ⅰ-5电气石载钼无机抑菌粉剂的表征

Ⅰ-6电气石载锰无机粉剂表征

附表Ⅱ蛋白表达谱鉴定的蛋白质及匹配序列

攻读学位期间发表的学术论文

哈尔滨工业大学博士学位论文原创性声明

致谢

个人简历