乳酸菌IIa类抗菌肽PCR筛选方法初步研究

摘要

化学防腐剂在食品保藏中发挥重要作用,然而有些化学防腐剂对人体有潜在的危害,因此天然的食品防腐剂受到人们青睐。乳酸菌在自然界分布很广泛,其常用于肉制品、发酵蔬菜、发酵乳制品的发酵与防腐,这是因为乳酸菌可产生一些蛋白质类物质,即抗菌肽。它在食品的防腐保鲜方面起重要作用。
　　目前研究较多的IIa类抗菌肽,其抑菌谱较为广泛,具有较大潜力开发成新型防腐剂。但目前大多数的抗菌肽筛选运用传统方法。该方法虽然有效,但它的筛选效率比较有限。随着抗菌肽的基因信息的不断揭示,利用抗菌肽的保守序列进行快速基因筛选已经成为可能。
　　本研究根据不同种属乳酸菌的抗菌肽的自身特点,设计相应种属特异性引物,用于筛选抗菌肽产生菌。对目前已经公布的50多株IIa类抗菌肽的基因信息进行聚类分析,得到了7个组别的特定保守序列的抗菌肽类群,针对这些保守序列设计得到了8组引物。以实验室现有保存的216株乳酸菌为筛选对象,依据抗菌肽的产生既存在于基因组DNA又存在于质粒DNA中,故相继提取了基因组和质粒DNA,用于抗菌肽的基因筛选。经优化PCR条件后,筛选到具有目标条带的菌株即疑似的产IIa抗菌肽的乳酸菌。为验证其序列的可靠性,故将阳性PCR产物连接到T载体中再进行测序比对,最后发现其基因序列与enterocinA的编码基因的同源性为99％,说明该菌携带enterocinA。为验证其真实的抑菌活性,采用双层平板法做抑菌活力验证,结果发现其中有一株乳酸菌对志贺氏菌和沙门氏菌有抑制活性。结果表明,本研究建立的PCR筛选方法,可用于IIa类抗菌肽的筛选,但是该方法尚属于探索阶段,后续还需要继续完善和补充。

目录

乳酸菌IIa类抗菌肽PCR筛选方法初步研究

PRELIMINARY STUDY OF A PCR SCREENING METHOD FOR CLASS IIA ANTIMICROBIAL PEPTIDES FROM LACTIC ACID BACTERIA

摘 要

Abstract

目录

第 1 章 绪 论

1.1 立题背景

1.2 抗菌肽概述

1.3 不同类型抗菌肽的分子结构与编码基因

1.4 不同类型抗菌肽的生物合成机制

1.5 抗菌肽的筛选方法

1.6 本课题研究的目的及意义

1.7 本课题主要研究内容

第 2 章 材料和方法

2.1 材料及仪器

2.2 实验方法

第 3 章 IIa 型抗菌肽聚类分析与筛选引物设计

3.1 IIa型抗菌肽聚类分析

3.2 IIa 型抗菌肽种属特异性引物的设计

3.3 IIa 型抗菌肽调控基因筛选引物的确定

3.4 本章小结

第 4 章 PCR 方法筛选与传统方法验证

4.1 乳酸菌的基因组DNA及质粒提取

4.2 PCR条件优化及扩增结果

4.3 传统方法的验证及抑菌物质的确定

4.4 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的论文

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哈尔滨工业大学硕士学位论文使用授权书

致 谢