南极细菌中抗低温致腐菌的筛选、鉴定及拮抗物质的研究

摘要

在南极极寒环境中,低温微生物具有明显优势,并发生一系列特殊的生理生化及代谢变化。基于以上南极菌的特殊性,本课题以南极低温菌株为实验对象,筛选出一株鱼类致腐菌的拮抗菌,并对其进行鉴定,并对其产生的活性物质进行了初步研究。
　　(1)以低温环境下腐烂海鱼中提取的致腐菌为指示菌,采用平板点种法和平板扩散法进行体外拮抗实验,从中筛选出一株有拮抗作用的菌种AN325。通过该菌株形态特征观察、生理生化指标测定和16SrDNA序列及其系统进化树分析,将AN325菌株鉴定为假交替单胞杆菌属。
　　(2)通过发酵培养条件可知,该菌株适宜在10℃的低温环境中发酵产生高活性的抑制物质,通气量与拮抗物质产量呈正相关,并且能耐受较广泛的pH和较高的盐度。该菌株在pH4.0和pH8.0条件下拮抗物质活性较高。葡萄糖为菌株产活性物质的最适碳源,酵母浸粉为最适氮源。
　　(3)对其拮抗物质进行性质初步测定。结果显示,拮抗菌AN325产生的拮抗物质为胞外产物;对pH影响敏感,在pH为11.0时活性最好;对温度变化敏感,在10℃时活性最好,此后,随温度升高活性逐渐降低直到消失;对蛋白酶K、胃蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶等敏感。
　　(4)硫酸铵沉淀不能有效沉淀拮抗物质;有机试剂中,乙醚、乙酸乙酯、正丁醇能萃取拮抗物质,但正丁醇的沸点较高,对低温拮抗物质有影响,乙醚较乙酸乙酯提取效果更好。菌株发酵上清液经乙醚萃取,旋转蒸发浓缩,薄层层析分离出4个样点,迁移率分别是0.102、0.742、0.829、0.857,经活性检测,第2、3、4样点有活性。研究结果表明,该菌株产生的拮抗活性物质不止一种。进一步的纯化和鉴定正在进行中。
　　以上研究以期进一步开发更适用于海产品以及其他食品低温保藏的微生物防腐剂,较之物理化学方法更安全。

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第1章 绪 论

1.1 课题来源及研究背景

1.2 海洋微生物代谢产物的简介

1.2.1 大环内酯类化合物介绍

1.2.2 环肽类化合物介绍

1.2.3 生物碱类化合物介绍

1.3 研究现状

1.3.1 食品生产工业中微生物防腐剂的应用现状

1.3.2 南极微生物及其活性物质

1.4 本课题的主要研究内容

1.4.1 研究目的

1.4.2 研究内容

第2章 拮抗菌株的筛选和鉴定

2.1 材料与方法

2.1.1 实验菌种

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.1.4 培养基

2.1.5 实验方法

2.2 结果与讨论

2.2.1 致腐6号菌的分离和致腐能力测定

2.2.2 拮抗菌株筛选结果

2.2.3 菌体形态观察及生理生化指标测定

2.2.4 AN325菌株的16S rDNA分子鉴定

2.2.5 菌株AN325对鱼类低温贮藏中的保鲜作用

2.3 本章小结

第3章 拮抗菌株发酵条件的研究

3.1材料与方法

3.1.1 实验菌种

3.1.2 实验试剂

3.1.3 实验仪器

3.1.4 培养基

3.1.5 实验方法

3.2 结果与讨论

3.2.1菌株生长和拮抗物质生成曲线

3.2.2盐度对拮抗物质产生的影响

3.2.3温度对拮抗物质产生的影响

3.2.4起始pH对拮抗物质产生的影响

3.2.5通气量对拮抗物质产生的影响

3.2.6不同碳源对拮抗物质产生的影响

3.2.7不同氮源对拮抗物质产生的影响

3.3本章小结

第4章 拮抗物质的性质分析和初步分离

4.1 材料与方法

4.1.1 实验菌种

4.1.2 实验试剂

4.1.3

4.1.4 培养基

4.1.5实验方法

4.2 结果与讨论

4.2.1 上清液的抑制性检测

4.2.2 AN325的生长曲线

4.2.3 发酵上清液抑菌活性的pH稳定性

4.2.4 发酵上清液活性物质的热稳定性

4.2.5 蛋白酶对抗菌物质活性影响

4.2.6 有机溶剂对发酵液活性物质的萃取

4.2.7 乙醇沉淀

4.2.8 硫酸铵沉淀

4.2.9 萃取浓缩

4.2.10 柱层析

4.2.11 薄层层析

4.3本章小结

结论

参考文献

声明

致谢