Ⅱa型抗菌肽PCR筛选方法的优化

摘要

消费者越来越关注食品添加剂与健康的关系。无防腐剂添加和化学物质处理的自然、传统的食物备受青睐。生物防腐已经成为了未来食品防腐的趋势,天然抗菌肽,因其天然、安全,受到研究者的瞩目。传统方法筛选抗菌肽存在工作量大、耗时较长、敏感性低的缺点。为弥补传统筛选方法的不足,急需建立新型抗菌肽筛选方法。
　　本课题组已经初步建立了基因筛选方法,检测和筛选了传统发酵食品中的大量乳酸菌,获得了1株产抗菌肽菌株。经传统方法证实,具有抑菌效果。表明该方法具有一定的可行性。但是该方法仍存在着不足,缺乏高通量筛选的特质。
　　本研究在初步PCR方法筛选的基础上,对IIa型抗菌肽的PCR筛选方法进一步优化,拟提高筛选效率;并且比较种属特异性引物筛选与简并引物筛选方法的优劣,建立高效的筛选方法,进而为建立抗菌肽产生菌的高通量筛选模型奠定基础。
　　本研究首先建立和优化了发酵乳中宏基因DNA提取方法,并提取12份马奶发酵乳的宏基因组DNA,用于初步筛选抗菌肽基因。此方法省去了事先筛选菌株的繁重工作,提高了抗菌肽筛选的效率。对3份阳性马奶发酵乳样品进行乳酸菌的分离和纯化,共获得118株乳酸菌。采用菌落PCR方法筛选乳酸菌,最终筛选获得了3株具有抗菌肽基因的菌株。经过传统抑菌实验验证,上述3株乳酸菌对李斯特菌均具有明显的抑菌效果。以其中抑菌效果较好的菌株C71基因组DNA为模板,分别扩增了完整的抗菌肽基因和成熟的抗菌肽基因,构建于表达载体pCold-SUMO上,获得了4种重组质粒。在嗜冷的大肠杆菌中,成功表达了抗菌肽基因。本研究优化了诱导表达的条件,确定了最佳的诱导时间为8h和最适IPTG浓度为0.2mmol/L。研究表明抗菌肽的前导肽对其抗菌活性无明显影响。本实验研究了煮沸法、裂解液溶解法、超声破碎法三种方法破碎细胞的效果。其中超声破碎法破碎菌体彻底,并且最大限度的保护了抗菌肽的完整性和活性。双层牛津杯抑菌试验结果表明,超声波破碎菌体获得的上清抑制李斯特菌效果明显。以上结果表明抗菌肽基因成功表达。与原始乳酸菌相比,原核表达的抗菌肽表达量显著提高,具有一定的应用的潜力。

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第1章 绪论

1.1课题研究的背景及意义

1.2国内外在该方向的研究现状及分析

1.3乳酸菌抗菌肽

1.4 乳酸菌抗菌肽的筛选方法

1.5 本课题主要研究内容

第2章 材料和方法

2.1 材料及仪器

2.2 实验方法

第3章 PCR方法筛选

3.1 传统发酵乳中宏基因组DNA的提取方法的建立和优化

3.2简并引物法和种属特异性PCR法筛选发酵乳样品

3.3发酵乳中乳酸菌的分离和产抗菌肽基因乳酸菌的筛选

3.4传统方法抑菌试验

3.5 产抗菌肽菌株的16S rRNA鉴定

3.6 本章小结

第4章 抗菌肽基因的原核表达

4.1 目标菌株抗菌肽基因的扩增

4.2 重组质粒的构建

4.3重组质粒的蛋白表达

4.4 本章小结

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

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