左归丸含药血清促进大鼠骨髓间质细胞向肝细胞分化的研究

摘要

目的：研究左归丸含药血清对骨髓间质细胞分化为肝细胞的影响，探讨中医补肾生髓成肝的机制，为促进骨髓干细胞向肝细胞分化的研究奠定实验基础，为补肾治疗肝病的临床应用提供科学依据。 方法：体外培养Wister大鼠肝组织块，收集其培养上清即为条件培养液。取Wister大鼠，随机分组后分别用生理盐水、中药左归丸浓缩煎剂、中药八珍汤浓缩煎剂以10ml/kg的量灌胃，持续15天，第15天灌胃后2小时，颈动脉插管取血，离心后获得正常大鼠血清、左归丸含药血清、八珍汤含药血清。采用贴壁分离，连续传代培养的方法纯化Wister大鼠骨髓间质细胞，反复传代后分为6组。常规培养组始终使用常规培养液(DMEM培养液+体积分数20％胎牛血清+2mmol/L谷氨酸胺)进行培养；HGF诱导组以常规培养液+促肝细胞生长因子(HGF，25ng/ml)和地塞米松(10-7M)进行培养；HGF加左归丸组以常规培养液+促肝细胞生长因子(HGF，25ng/ml)和地塞米松(10-7M)+10％的左归丸含药血清进行培养；条件培养液加对照血清组以常规培养液+50％的条件培养液+10％正常大鼠血清进行培养；条件培养液加八珍汤组以常规培养液+50％的条件培养液+10％八珍汤含药血清进行培养；条件培养液加左归丸组以常规培养液+50％的条件培养液+10％左归丸含药血清进行培养。培养时间持续28天，动态观察细胞形态变化并于培养第0、7、14、21、28天时留取细胞，免疫细胞化学方法检测肝细胞表面标记CK18、AFP、ALB的表达，PAS染色检测糖原的表达。各标本在统一放大倍数(400×)下，随机选取数个视野，数阳性与阴性细胞数，计算阳性细胞率，比较不同培养组之间差异，两样本间均数比较采用t检验。 结果：诱导后约3天左右即有少量细胞形态开始变化，表现为肝细胞样细胞形态；7～8天呈多边形，胞浆丰富，核大；10天左右与肝细胞体外贴壁形态几乎一样。随着诱导时间的延长，肝细胞样的细胞数量也渐增多。诱导后28天，肝细胞样的细胞仍存活。对照组的细胞仍然呈梭形，传代至15代时细胞开始变得宽大、扁平，逐渐脱壁死亡。左归丸含药血清能促进这一诱导作用，与对照组比较，在诱导后7、14、21、28天，肝细胞样的细胞数量有显著增加的同时，其形态更接近正常肝细胞。常规培养组细胞仅见极少数细胞表达AFP及ALB，各时间点比较阳性细胞率无显著差异。HGF诱导组、HGF加左归丸组、条件培养液加对照血清组、条件培养液加八珍汤组、条件培养液加左归丸组等实验组细胞0天时AFP、ALB仅极少数细胞表达，CK18及糖原未见表达；其总体趋势表现为，AFP在7天时表达明显升高，14、21天时表达又快速减弱，28天时仅少数细胞表达；CK18、ALB及糖原在7天时少量表达，14、21、28天时表达明显逐渐升高。诱导7天时，其AFP阳性细胞率HGF诱导组(63.2±2.6)、HGF加左归丸组(78.9±3.1)、条件培养液加八珍汤组(43.0±2.3)和条件培养液加左归丸组(82.5±3.0)，以上各含左归丸药物血清实验组与对照组比较，差异显著(P＜0.05)。诱导28天时，HGF诱导组其阳性细胞率(％)CK18(60.7±2.3)、ALB(61.3±2.6)、糖原(52.6±2.7)；HGF加左归丸组其阳性细胞率(％)CK18(72.6±2.7)，ALB(78.8±3.4)、糖原(69.2±2.8)；条件培养液加八珍汤组其阳性细胞率(％)CK18(62.8±2.3)，ALB(60.5±2.3)、糖原(59.8±2.4)；条件培养液加左归丸组其阳性细胞率(％)CK18(82.2±2.9)，ALB(89.0±2.9)、糖原(89.3±3.2)；以上各含左归丸药物血清实验组与对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)。 结论：左归丸含药血清可明显提高骨髓间质细胞向肝细胞的转化率，中医补肾(左归丸)对骨髓细胞向肝细胞的分化具有促进作用。

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