清热解毒与滋阴清热、活血化瘀对T2DM PI3K信号转导影响的比较研究

摘要

目的：本课题在前期畿白草能有效降血糖、保护胰岛B细胞的研究基础上，结合中医辩证论治的思维原则、中医对DM病因病机和病程演变的理解，拟对清热解毒、滋阴清热、活血化瘀对T2DM及其血管病变，对骨骼舰细胞胰岛素PI3K信号转导的影响进行比较研究，分别选用翻白草、生地、丹参代袭清热解毒、滋阴清热、活血化淤。观测清热解毒与滋阴清热、活血化淤对T2DM大鼠糖代谢影响的比较；对T2DM大鼠血清NO和ET影响的比较；对T2DM大鼠腹主动脉超微结构影响的比较；对T2DM犬鼠骨骼肌超微结构影响的比较；对T2DM大鼠骨骼肌PI3K信号转导上的影响．旨在从信号转导通路的角度探索清热解毒、滋阴清热、活血化瘀防治DM及其并发症的实质，探讨热毒在DM及其并发症发生发展过程中的地位，为中医药防治DM的研究提供新思路。 方法： 1、理论研究：对DM的流行病学、病因及发病机制、分型及诊断、治疗以及其并发症发病机制等进行系统文献复习研究，查阅近年来国内外的相关研究文献资料，对资料进行较为系统的总结和综述，掌握相关研究项目和指标的科研前沿动态。对传统中医理论关于DM病因病机、辨证论治、治法、方药的文献进行系统复习研究，查阅近年来中医学的相关研究文献资料，对资料进行较为系统的总结和综述，掌握相关文献资料的研究成果和研究动态。 2、实验研究： (1)Wistar大鼠84只，随机选取7只为正常组；其余77只予以高热量高糖高脂饮食加链脲佐菌素(STZ)腹腔注射造模，造模成功后随机分为模型组、格列奇特组、翻白草大、中、小剂量组、丹参大、中、小剂量组和生地大、中、小剂量组，每组7只．造模结束后改为普通饮食，分别予以相应药物进行治疗，连续4周。 (2)分剐子治疗开始前、治疗结束后称量体重． (3)分别于治疗开始前、治疗结束后，采末梢血，使用罗氏优越血糖仪检测血糖。 (4)分别于开始治疗前、治疗结束后，采静脉血，采用放射免疫分析法检测血清胰岛素。 (5)分别于治疗开始前、治疗结束后，采静脉血，采用硝酸还原酶法检测血清一氧化氮(NO)． (6)分别于治疗开始前，治疗结束后，采用放射免疫分析法检测血清内皮素(ET)． (7)实验结束后，处死大鼠，取腹主动脉，制作超薄切片，醋酸铀一枸橼酸铅双重染色，电镜观察腹主动脉超微结构。 (8)实验结束后，处死大鼠，取腹壁肌，制作超薄切片，醋酸铀一枸橼酸铅双重染色，电镜观察骨骼肌细胞超微结构。 (9)实验结束后，处死大鼠，取腹壁肌，采用蛋白质SDS-PAGE电泳、免疫印迹法等方法，检测骨骼肌细胞磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)、磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDKI)、葡萄糖转运蛋白4(GluT4)蛋白的表达。 结果： (1)理论研究：中医历代先贤诸家的论述明确指出消渴之为病，不论何种原因、在何病位，皆由热火内盛、怫郁结滞，耗伤阴津，导致津液亏损所致；消渴并发症的发生亦与燥热炽盛有关，如消渴并发痈疽便是热火炽盛之明证．而“毒者，邪气蕴结不解之谓”，“邪盛谓之毒”，热火炽盛、蕴结持久而为热毒．故而认为热毒是促使DM发生发展和产生并发症的基本致病因素和重要病理机制。另外，清热解毒法治疗DM得到了临床的验证，确有疗效，也反证了热毒在DM病因病机中的地位。 (2)清热解毒与滋阴清热、活血化瘀对T2DM大鼠糖代谢的影响：翻白草大、中剂量组、丹参大、中剂量组和生地大、中、小剂量组大鼠体重显著增加(P<0.01)；翻白草小剂量组、丹参小剂量组体重明显增加(P<0.05)；翻白草中剂量组体重增幅高于生地中剂量组，但两者比较无统计学意义；翻白草中剂量组体重增幅显著高于丹参中剂量组(P<0.01)，生地中剂量组体重增幅明显高于丹参中剂量组(P<0.05)。 翻白草大剂量组血糖治疗前后相比明显降低(P<0.05)；翻白草中、小剂量组血糖治疗前后相比均显著降低(P<0.01)．丹参大、中、小剂量组血糖治疗前后相比均有所降低，但无统计学意义(P>0.05)．生地大、中剂量组血糖治疗前后相比均有显著降低(P<0.01)；生地小剂量组血糖治疗前后相比明显降低(P<0.05)；翻白草中剂量组血糖降幅大于生地中剂量组，但两者比较无统计学意义(P>0.05)；翻白草、生地中剂量组血糖降幅显著大于丹参中剂量组(P<0.01)。 翻白草大、中、小剂量组血清INs治疗前后相比显著升高(P<0.01)．丹参大、中、小剂量组血清INs治疗前后相比显著降低(P<0.01)；生地大剂量组血清INs治疗前后相比显著升高(P<0.01)；生地中、小剂量组血清INS治疗前后相比明显升高(P<0.05)；翻白草中剂量组血清INS增幅高于生地中剂量组，但无统计学意义《P>0.05)。 (3)清热解毒与滋阴清热、活血化瘀对T2DM大鼠血管活性因子的影响：翻白草大、中剂量组大鼠血清NO治疗前后显著降低(P<0.01)，小剂量组明显降低(P<0.05)；丹参大剂量组大鼠血清NO治疗前后显著降低(P<0.01)，中、小剂量组明显降低(P<0.05)；生地大、中剂量组大鼠血清NO治疗前后显著降低(P<0.01)，小剂量组明显降低(P<0.05)；丹参各剂量组NO降幅最大，生地相应剂量组次之，翻白草相应剂量组再次之，但无统计学意义(以中剂量组比较)(P>0.05)；三者的各剂量组中，均以大剂量组效果为最好，中剂量组次之，小荆量组再次之，但三者的各剂量组之间比较均无显著性差异(P>0.05)。 翻白草、丹参、生地各剂量组大鼠血清ET治疗前后均显著降低(P<0.01)；翻白草各剂量组大鼠血清ET降幅均大于生地各相应剂量组，但无统计学意义(P>O.05)；翻白草、生地各剂量组大鼠血清ET降幅均显著大于丹参各相应剂量组(P<0.1)；三者各剂量组中均以大剂量组ET降幅最大、中剂量组次之、小剂量组再次之，三者各剂量组中的大剂量组ET降幅均显著大于小剂量组(P<0.01)，余皆无差异(P>0.05)。 (4)清热解毒与滋阴清热、活血化瘀对T2DM大鼠腹主动脉超微结构的影响：模型组腹主动脉血管内发细胞(VEC)结构受损较重，通透性增高，细胞肿胀、脱落；血管平滑肌细胞(VSMC)增殖并向内膜迁移，胶原纤维增生、管壁硬化，线粒体肿胀。格列奇特组、翻白草各剂量组、丹参各剂量组、生地各剂量组腹主动脉VEC、VSMC的损伤有不同程度减轻；其中翻白草、丹参、生地各剂量组中均以大剂量效果最好、中剂量次之、大剂量再次之；翻白草、生地各相应剂量组效果基本相当，而均优于丹参各相应剂量组。 (5)清热解毒与滋阴清热、活血化瘀对T2DM大鼠骨骼肌超微结构的影响：T2DM模型组大鼠骨骼肌组织结构受损严重，主要表现为肌原纤维排列紊乱、断裂；肌节结构不完整且模糊；线粒体体积增大，部分线粒体明显肿胀、电子密度低，线粒体嵴排列紊乱或中断或肿胀；糖原颗粒显著增多，有较多脂滴；间质内有明显的胶原纤维增生。翻白草各剂量组、丹参各剂量组，生地各剂量组大鼠骨骼肌组织损伤均较模型组有不同程度的减轻，且均以大剂量组效果最好、中剂量组次之、小剂量组损伤再次之；其中翻白草与生地的相应剂量组的效果基本相当，而优于丹参的相应剂量组。 结论： (1)热毒是促使DM发生发展和产生并发症的基本致病因素和重要病理机制． (2)清热解毒与滋阴清热均能有效降低T2DM大鼠血糖，两者作用效果基本相当，但清热解毒略优于滋阴清热；活血化瘀则不能有效降低血糖。翻白革降血糖作用的机理可能是： ①保护胰岛B细胞，促进INS分泌； ②上调胰岛素敏感组织骨骼肌细胞胰岛素信号转导，增加血糖向骨骼肌细胞内转移。 生地降血糖作用的机理可能是： ①促进INs分泌； ②上调胰岛素敏感组织骨骼肌细胞胰岛素信号转导，增加血糖向骨骼肌细胞内转移．丹参不能有效促进INs分泌，亦不能上调骨骼肌细胞胰岛素信号转导，从而不能有效控制DM大鼠血糖． (3)清热解毒与滋阴清热、活血化瘀均能有效降低T2DM大鼠VEC损伤，减少VSMC增生，从而达到防治糖尿病大血管病交的目的。清热解毒、滋阴清热的作用效果相当，但清热解毒略优于滋阴清热；两者均优于活血化瘀。翻白草、生地防治大血管病变的作用机理可能是： ①有效地降低血糖，减少高血糖毒性对VEC、VSMC的损害； ②降低VEC分泌ET，减少ET对VEC、VSMC的损害； ③下调NO的生成，降低高浓度NO的细胞毒性作用． 丹参防治大血管病变的作用机理可能是： ①降低VEC分泌ET，减少ET对VEC、VSMC的损害； ②下调NO的生成，降低高浓度NO的细胞毒性作用． (4)清热解毒与滋阴清热、活血化瘀均能有效保护骨骼肌组织，减轻骨骼肌组织损伤。清热解毒与滋阴清热的效果相当，但清热解毒略优于滋阴清热；两者均优于活血化瘀。翻白草、生地防治糖尿病骨骼肌病变的作用机理可能是： ①有效促进INS分泌、降低T2DM大鼠血糖，改善糖代谢紊乱，进而降低高血糖毒性所介导的骨骼肌损伤； ②上调骨骼肌细胞胰岛素信号转导，促进葡萄糖向骨骼肌细胞转运，促进血糖利用，保护骨骼肌功能。丹参防治糖尿病骨骼肌病变的作用机理可能是：通过其有效成分丹酚酸类化合物的强抗氧化作用，清除氧自由基，降低ROS的毒性作用，实现对骨骼肌结构和功能的保护。

目录

论文说明：主要英文缩略词

声明

前言

第一部分理论研究

1.中医学对糖尿病的认识

2.“热毒”与DM

参考文献

第二部分实验研究

实验一 清热解毒与滋阴清热、活血化瘀对T2DM大鼠糖代谢影响的比较研究

实验二 清热解毒与滋阴清热、活血化瘀对T2DM大鼠血管活性因子影响的比较研究

实验三 清热解毒与滋阴清热、活血化瘀对T2DM大鼠腹主动脉超微结构影响的比较研究

实验四 清热解毒与滋阴清热、活血化瘀对T2DM大鼠骨骼肌超微结构影响的比较研究

实验五 清热解毒与滋阴清热、活血化瘀对T2DM大鼠骨骼肌PI3K信号转导影响的比较研究

第三部分总结

第四部分文献综述

文献综述一《内经》病因学说浅析

文献综述二从“毒”论糖尿病的病因病机

在读期间发表的论文、论著及科研工作情况

附图

致谢