异戊烯焦磷酸刺激的外周血单个核细胞对HepG2.2.15细胞中HBV复制和表达的影响

摘要

目的：探讨慢性乙肝病人和健康志愿者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)经异戊烯焦磷酸（Isopentenyl pyrophosphate, IPP）刺激后细胞扩增、干扰素γ（Interferon-gamma, IFN-γ）分泌及PBMCs中γδT细胞增殖情况。观察经IPP刺激的γδT细胞对HepG2.2.15细胞中HBV DNA复制及HBsAg和HBeAg表达的抑制效应。
　　方法：⑴采集健康人或慢性乙型肝炎病人外周血，用 Ficoll-Hypaque分离液分离PBMCs，经Hanks液洗涤后，用含10％新生牛血清（new cattle serum, NCS）和5%人AB型血浆的RPMI1640培养液重悬，调浓度为1×106/ml，补充IPP和重组人白介素2（recombinant human interlekin2, rhIL-2），置37℃、5%CO2培养10天，收集细胞，进行实验。培养前后对细胞进行计数及采用流式细胞术检测γδT细胞百分比。⑵收集培养后1、4、7、10天的上清液，酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测上清液中IFN-γ含量。⑶γδT细胞与HepG2.2.15细胞分别按10:1、20:1两种比例接种于24孔板中混合培养，收集24h，48h，72h混合培养上清。采用Transwell培养系统将两种细胞分隔开，效靶比为20:1进行培养，同时设混合培养组、培养10天的γδT细胞上清效应组及HepG2.2.15细胞对照组，收集72h上清，并提取各孔中HepG2.2.15细胞内HBV DNA。采用ELISA法检测上清液中HBsAg、HBeAg含量；采用荧光定量PCR方法检测HBV DNA含量。⑷直接免疫荧光染色法检测HepG2.2.15细胞膜上IFN-γ受体表达。
　　结果：⑴经IPP刺激10天后，正常对照组的PBMCs数量和γδT细胞含量分别从(1.39±0.21)×106/ml和(4.34±1.79)%增至(8.67±1.70)×106/ml和(55.65±6.88)%；慢性乙肝病人的PBMCs数量和γδT细胞含量分别从(0.86±0.17)×106/ml和(4.75±1.50)%增至(5.17±0.84)×106/ml和(54.08±4.28)%。刺激前后两组之间的γδT细胞比例无明显差异性，但刺激前后慢性乙肝病人细胞总数明显少于正常对照组，两组间差异有显著性。⑵PBMCs经IPP刺激培养后IFN-γ分泌量较不含IPP的对照组有显著增高，至第7天达峰值。⑶混合培养后，IPP对HepG2.2.15细胞中的HBsAg、HBeAg的表达及HBV DNA的复制没有明显的影响。各组中γδT细胞对HepG2.2.15细胞中HBsAg表达的抑制效应不明显。各组中γδT细胞对HepG2.2.15细胞中HBeAg表达均有一定的抑制效应。正常组在10:1浓度比例时，在24、48、72h的抑制率分别为(14.05±7.54)%，(15.56±3.32)%，(23.72±5.49)%；在20:1浓度比例时，抑制率分别为(31.25±8.58)%，(39.31±5.42)%，(43.11±1.93)%；病人组在10:1浓度比例时，抑制率分别为(18.69±8.09)%，(13.48±5.01)%，(20.11±4.29)%；在20:1浓度比例时，抑制率分别为(29.31±5.46)%，(33.40±2.95)%，(40.88±9.59)%。对HBV DNA进行检测，结果各组中HBV DNA copy数和对照组相比较，都有显著下降，且高浓度比低浓度效应更为明显。正常组和病人组中γδT细胞在相同的效靶比值时，对HepG2.2.15细胞中HBeAg、HBV DNA抑制效应差异无统计学意义。⑷Transwell系统培养，结果混合组、Transwell组、γδT细胞上清液组的HBeAg的表达、HBV DNA的复制均有下降，和HepG2.2.15细胞对照组相比较有统计学意义。Transwell组、上清液组和混合组各组之间抑制效应差异无统计学意义。
　　结论：⑴CHB病人外周血中的单个核细胞数和γδT细胞数量均少于正常健康人，但γδT细胞的百分含量和正常人无明显差异性。IPP联合 rhIL-2对正常人和 CHB病人中的γδT细胞均能有效刺激增殖。⑵IPP刺激γδT细胞后能有效分泌IFN-γ。⑶IPP刺激培养后的γδT细胞能够抑制HepG2.2.15细胞中的HBeAg表达和HBV DNA复制，且高浓度是比低浓度时更为有效，但对HBsAg表达的抑制作用不明显。⑷γδT细胞对HepG2.2.15细胞中的HBeAg表达和HBV DNA复制的抑制效应是非溶细胞性的，主要由γδT细胞分泌的细胞因子发挥作用，IFN-γ可能是发挥作用的主要细胞因子之一。

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前言

材 料 和 仪 器

1. 实验材料

2. 实验仪器

实 验 方 法

1. 实验分组

2. 外周血单个核细胞样品的分离

3. γδT细胞的培养

4. 流式细胞仪检测标本制备

5. HepG2.2.15细胞的培养

6. ELISA法定量检测培养上清中IFN-γ分泌情况

7. 直接免疫荧光染色检测HepG2.2.15细胞上IFN-γR表达情况

8. 混合细胞培养实验

9. Transwell渗透培养实验

10. ELISA法检测收集的培养上清液HBsAg、HBeAg表达

11.胞内HBV DNA 的提取

12.实时荧光定量PCR检测HBV DNA含量

13.统计学处理

实 验 结 果

1. IPP刺激PBMCs培养前后γδT细胞含量测定

2. PBMCs培养过程中细胞形态学观察结果

3. PBMCs培养过程中上清液中IFN-γ检测结果

4. 混合培养后上清液检测的HBsAg，HBeAg及HBV DNA结果

5. Transwell渗透系统混合培养后检测的HBeAg、HBV DNA结果

6. 直接免疫荧光染色检测HepG2.2.15细胞IFN-γR表达情况

讨论

一、观察IPP刺激PBMCs增殖情况及检测γδT细胞含量的意义

二、γδT细胞对HepG2.2.15细胞中HBV DNA复制及HBsAg、HBeAg表达的影响

三、γδT细胞非溶性对HepG2.2.15细胞中HBV DNA复制及HBeAg表达的作用

四、IFN-γR检测结果及其意义

结论

参考文献

致谢

附录

1.实验中定量检测标准线性图

2.中英文缩略词对照表

3.个人简历

4．综述: γδT细胞与病毒免疫