嗜热菌W16利用秸秆水解液混合糖产氢特性及代谢机制研究

摘要

废弃物处理能源化符合国家节能减排和低碳发展战略需求，也是环境领域关注的热点问题之一。利用丰富而廉价的可再生秸秆类生物质制取氢气是一种获得氢气的新方法，在产生可再生清洁能源的同时可以有效解决农业废弃物的处置问题，是未来能源发展的主要趋势。然而，由于秸秆类生物质的复杂性及难降解性，如何高效获取富含葡萄糖和木糖混合糖的秸秆水解液，以及解决目前发酵产氢微生物木糖代谢能力不足的问题对于实现秸秆废弃物资源的高值利用至关重要。本研究以本实验室筛选得到的能够利用葡萄糖木糖发酵嗜热产氢菌热解糖厌氧芽孢杆菌W16（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16）为研究对象，以建立经济高效转化秸秆类生物质产氢体系为目标展开研究，考察了产氢菌W16葡萄糖木糖共利用发酵产氢规律，提出了采用补料分批发酵方式解决混合底物中木糖利用率低的问题；并分析了不同葡萄糖木糖碳源响应下细胞的代谢差异特征及可能的代谢调控机制，为实现葡萄糖木糖混合糖的同步高效转化提供重要的理论基础；在此基础上，采用生物法预处理及酶解糖化玉米秸秆，探讨了产氢菌W16利用玉米秸秆水解液发酵产氢效能，为实现农业废弃物玉米秸秆的高值利用以及生物转化过程经济可行性提供技术理论依据。
　　通过不同葡萄糖木糖混合糖浓度比下发酵产氢特性，确定了产氢菌W16能够同时利用葡萄糖和木糖发酵产氢，但与葡萄糖的利用相比，木糖的消耗速率随着混合糖中葡萄糖浓度的升高而不断下降，结合节点插值拟合分析表明，当混合糖中葡萄糖含量高于58.2.％时，其对木糖利用的抑制作用明显增大，而当葡萄糖含量降至21.7%以下，其自身利用会受到一定程度反馈抑制。针对高葡萄糖木糖浓度比下木糖利用率低的问题，提出连续以及补料分批发酵过程稀释率及水力停留时间（Hydraulic retention time, HRT）调控策略，其中采用补料分批发酵方式，通过控制各段运行参数，在HRT为12h条件下，产氢速率达到最大值8.9 mmol/L/h的同时，相应的葡萄糖木糖利用率分别提升至92.2%以及82.2%。
　　采用Illumina2000高通量测序平台转录组学测序技术探究产氢菌 W16葡萄糖木糖共发酵产氢内在分子机理。对产氢菌 W16在葡萄糖，木糖以及葡萄糖木糖混合糖作为碳源下差异基因的调控与表达情况进行分析，结果表明产氢菌 W16在不同碳源下编码木糖特异性转运蛋白基因高丰度是实现葡萄糖木糖共利用的主要因素。而当葡萄糖在混合糖中大量存在时，木糖异构酶的高葡萄糖亲和力导致即使木糖转运蛋白基因高丰度，木糖利用仍受到一定程度抑制。当混合糖基质中木糖大量存在时，葡萄糖磷酸转移酶系统基因丰度普遍下降，造成葡萄糖利用减缓。以上糖转运蛋白在不同混合糖下表达差异是菌株 W16实现葡萄糖木糖共发酵，并且在发酵过程中存在相互影响的主要原因。
　　基于菌株W16利用葡萄糖木糖发酵产氢特点，建立合理有效的玉米秸秆预处理及酶解糖化方式。通过不同预处理方式下玉米秸秆化学组分及形态结构比较结果表明，采用白腐真菌CGMCC5.776（Phanerochaete chrysosporium CGMCC5.776）生物预处理玉米秸秆在去除35.3%木质素，降低纤维素结晶度的同时，只有9.5%的全纤维素损失。该预处理过程可以有效强化玉米秸秆酶解糖化效能至原来的1.6倍。同时，选用绿色木霉CGMCC3.2876（Trichoderma viride CGMCC3.2876）胞外粗酶液对生物预处理玉米秸秆进行酶解糖化，在温度49.7℃，pH5.0，酶投加量35.7 IU/g，以及底物浓度为38.5 g/L的最优条件下，每100g玉米秸秆能够产生27.2g可溶性还原糖，高达理论值的67%。通过采用批式，连续以及补料分批发酵方式发酵产氢发现，在补料分批发酵方式下产氢菌 W16利用生物预处理玉米秸秆水解液发酵产氢，最高产氢速率可达到9.1 mmol/L/h。为进一步提高产氢效能，提出了糖水解-暗发酵一体式产氢对策，实验结果表明，通过调整反应过程中温度，底物浓度以及酶投加量，糖化及发酵产氢过程可以在有效缩短反应时间至72h的同时，产氢量达到89.3 mL H2/g-玉米秸秆。

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第1章 绪 论

1.1 课题背景

1.2 氢能与生物制氢技术

1.3秸秆原料的开发潜力

1.4秸秆水解液混合糖的获取

1.5秸秆水解液葡萄糖木糖发酵产氢

1.6本文的研究目的和意义

1.7 本文的主要研究内容和技术路线

第2章 试验材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 分析方法

第3章 嗜热菌W16葡萄糖木糖共利用产氢特性研究

3.1 引言

3.2菌株W16批式发酵产氢特性研究

3.3菌株W16连续发酵产氢特性研究

3.4菌株W16补料分批发酵产氢特性研究

3.5 本章小结

第4章 嗜热菌W16葡萄糖木糖共利用代谢机制研究

4.1 引言

4.2 菌株W16不同碳源下测序质量评估

4.3 菌株W16不同碳源下基因差异表达分析

4.4 菌株W16不同碳源下基因GO功能富集分析

4.5 菌株W16不同碳源下KEGG通路分析

4.6 本章小节

第5章 嗜热菌W16利用玉米秸秆水解液发酵产氢

5.1 引言

5.2 玉米秸秆原料的预处理

5.3 预处理后玉米秸秆原料的酶解糖化条件优化

5.4 分步糖化发酵产氢研究

5.5 同步糖化发酵产氢研究

5.6 不同木质纤维原料发酵产氢能力比较

5.7 本章小结

结论

论文的主要创新点：

建议与展望：

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文及其它成果

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