乳酸菌胞外多糖诱导结肠癌HT-29细胞凋亡的机制研究

摘要

结肠癌是人类高发恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康，结肠癌的有效防治已经成为全球关注的热点。结肠癌的发病与饮食、遗传、运动不足、吸烟饮酒及慢性结肠直肠疾病等多种因素有关，其中饮食是最重要的影响因素。乳酸菌胞外多糖被证实具有免疫调节、抗肿瘤等生物活性，但是对于乳酸菌胞外多糖诱导结肠癌细胞凋亡的相关机制很少报道。因此，本课题采用实验室自行分离得到的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracaseisubp.paracaseiM5(L.paracaseiM5)，发酵提取胞外多糖，并通过与结肠癌HT-29细胞共同培养来研究其诱导结肠癌HT-29细胞凋亡的作用及机制。本研究主要内容包括：
　　⑴提取由本实验室分离鉴定得到的Lactobacillus paracaseisubp. paracasei M5,Lactobacillus paracaseisubp. paracaseiX12, Lactobacillus coryniformissubp. torquens T3等三株乳酸菌的胞外多糖，通过 MTT实验结果可知 Lactobacillus paracaseisubp. paracaseiM5胞外多糖（M5-EPS）的抑制作用最佳，用于后续研究；500μg/mL和1000μg/mL的M5-EPS作用于HT-29细胞48 h时抑制效果最好；随后将M5-EPS的发酵条件进行优化，当pH值为6.5，菌液浓度为108 CFU/mL，发酵温度为37℃，发酵时间为12 h时，最终得到的M5-EPS量最多；倒置显微镜下直接观察 M5-EPS处理后的HT-29细胞，与对照组相比，数目明显减少，说明M5-EPS可明显抑制HT-29细胞的生长；Hoechst33258荧光染料对HT-29细胞进行染色发现 M5-EPS可以导致 HT-29细胞形态变化；通过透射电镜观察 M5-EPS处理之后HT-29细胞的超微结构，结果显示HT-29细胞出现了明显的凋亡特征，如细胞质不均匀，内部细胞器紊乱，内质网发生了严重的肿胀；最后，通过流式细胞仪测定HT-29细胞的周期，表明M5-EPS可通过G0/G1的阻滞起到抑制细胞增殖的作用。
　　⑵M5-EPS可以破坏HT-29细胞内部氧化系统的平衡：采用荧光标记法以及流式细胞术检测HT-29细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平，结果显示和对照组相比，M5-EPS处理组可明显的提高细胞内 ROS水平，且呈现浓度依赖性；从基因角度，通过RT-PCR的手段得知M5-EPS可以显著的降低HT-29细胞内SOD、CAT和GSH-PX等抗氧化酶基因表达水平；从蛋白水平检测SOD、CAT和GSH-PX等酶活力，最终结果与PCR结果相一致；通过N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）抑制细胞内氧化应激后，倒置显微镜下观察，与 M5-EPS直接处理相比，可以明显增加 HT-29细胞数目，细胞生长形态良好。综上所述，氧化应激途径参与M5-EPS诱导HT-29细胞凋亡的过程，通过提高HT-29细胞ROS水平，并降低抗氧化酶活性致使细胞氧化系统失衡来抑制HT-29细胞的生长。
　　⑶M5-EPS可以通过激活内质网应激途径，影响HT-29细胞的生长：流式细胞仪检测M5-EPS处理后，HT-29细胞内钙网蛋白（CRT）量增加，这说明可能启动内质网应激通路；M5-EPS可以显著的提高 HT-29细胞内内质网应激因子GRP78、ATF4和C HOP mRNA的表达量，且基本呈现浓度依赖性；测定与凋亡相关的因子，结果显示 M5-EPS能够显著的提高促凋亡因子 caspase-3、Ba x和Bad基因的表达，显著降低抗凋亡因子Bcl-xl基因的表达；经过NAC处理后，检测细胞内ROS的变化，与M5-EPS直接处理相比荧光强度明显降低，说明氧化应激途径受到抑制；RT-PCR法检测氧化应激途径抑制之后细胞内GRP78和CHOP mRNA的表达量，内质网因子表达量都显著降低，表明氧化应激可以影响内质网应激途径的激活。

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第1章 绪 论

1.1 课题研究背景及研究目的和意义

1.2 乳酸菌胞外多糖的研究进展

1.3 内质网应激

1.4 氧化应激

1.5 本课题主要研究内容

第2章 材料和方法

2.1 材料及仪器

2.2 基本实验操作

2.3 乳酸菌胞外多糖的提取和筛选

2.4 乳酸菌胞外多糖诱导HT-29凋亡的研究

2.5 乳酸菌胞外多糖诱导HT-29凋亡中氧化应激机制的研究

2.6 乳酸菌胞外多糖诱导HT-29凋亡中内质网应激机制的研究

2.7 数据统计与分析

第3章 M5-EPS诱导HT-29凋亡的研究

3.1 前言

3.2 胞外多糖的提取和筛选

3.3 乳酸菌胞外多糖诱导HT-29凋亡的研究

3.4 本章小结

第4章 氧化应激机制的研究

4.1 前言

4.2 M5-EPS对HT-29细胞内ROS的影响

4.3 RT-PCR检测HT-29细胞内抗氧化酶基因的表达

4.4 SOD，CAT和GSH-PX酶活的变化

4.5 NAC处理后HT-29细胞数目的变化

4.6 本章小结

第5章 内质网应激机制的研究

5.1 前言

5.2 M5-EPS诱导HT-29中钙网蛋白的变化

5.3 M5-EPS诱导HT-29发生内质网应激

5.4 M5-EPS对凋亡相关因子的影响

5.5 NAC处理后，HT-29细胞内ROS的变化

5.6 NAC处理对内质网应激的影响

5.7 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的论文及其他成果

声明

致谢