鹅副粘病毒HN和F基因克隆、序列分析及原核表达载体的构建

摘要

鹅副粘病毒(GPMV)是副粘病毒科,副粘病毒亚科,腮腺炎病毒属,APMV-1中的成员,引起鹅副粘病毒病.该病自1997年由扬州大学王永坤教授报道以来,在国内很多地区的鹅群中流行.鹅副粘病毒病是以消化道病变为主要特征的具有高度发病率和死亡率的烈性传染病,给这些地区的养鹅业造成了巨大的经济损失.初步实验表明,GPMV与传统的NDV的致病性不同,并且常规的NDV疫苗不能提供有效的保护.因此从分子生物学水平上对该病原进行研究具有重要的意义.血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白和融合(F)糖蛋白是GPMV的两种主要的囊膜糖蛋白.HN糖蛋白具有血凝素和神经氨酸酶两种活性,F糖蛋白的裂解能力是病毒毒力的主要决定因素.该研究根据GenBank发表的GPMVSF02株及其它NDV全基因序列,借助Oligo4.1软件,分别设计两对和一对引物,分别采用RT-巢式PCR和RT-PCR方法对鹅副粘病毒JS/1/97/Go株的HN基因和F基因进行了体外扩增,扩增出与预期设计大小相符的HN基因和F基因的特异性条带.将扩增出的DNA片段克隆到pMDl8-T载体中,转化TG1感受态细胞,经AMP/IPTG/X-gal平板筛选,酶切和PCR鉴定后获得阳性重组质粒.序列测定表明:HN基因全长1716bp,编码571个氨基酸残基,与参考序列比较,核苷酸的同源性为82.1﹪-98.4﹪,推导氨基酸同源性为88.3﹪-99.5﹪,有4个糖基化位点,其中3个高度保守.F基因全长为1662bp,编码553个氨基酸残基,与参考序列相比,核苷酸的同源性为84.2﹪-99.8﹪,氨基酸同源性为87.7﹪-99.8﹪,有6个糖基化位点,其中5个高度保守.F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为<'112>R-R-Q-K-R-F<'117>,与NDV的强毒株特征相符.根据测序结果,利用DNAstar软件预测抗原表位,参考测得的HN基因的序列设计一条引物,扩增HN基因5'端的含有三个抗原表位的基因片段(命名为HNp),测序结果表明长为606bp,编码201个氨基酸残基,与HN全长基因的相应区域同源性比较,核苷酸和氨基酸残基各有2个变异,但不改变表位预测结果.将HN基因和HNp基因亚克隆到原核表达载体pProEX HTb中,将鉴定为阳性的重组质粒转化到DH5α中.将F基因分别亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1和原核表达载体pET-30a(+)中,将鉴定为阳性的重组质粒转化到TGl中.该实验克隆了JS/1/97/Go株的HN基因和F基因,根据测序结果进行序列分析,并与参考的NDV毒株进行了核苷酸和推导氨基酸的同源性比较,为证实GPMV和传统NDV之间的亲缘关系提供了理论基础,同时预测了F和HN基因的抗原表位,构建了含有GPMV的F基因、HN基因、HNp基因的原核表达载体,为原核表达和进一步研究GPMV的致病性及鉴别诊断提供了分子生物学水平上的理论依据,并为表位疫苗的研究奠定了基础.

目录

文摘

英文文摘

1引言

1.1 GPMV生物学性状

1.2 GPMV基因组及其编码蛋白

1.2.1基因组结构

1.2.2基因表达方式

1.2.3编码的蛋白及其功能

1.3鹅副粘病毒与NDV的关系

1.4研究的目的与意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1病毒

2.1.2质粒与菌种

2.1.3扩增引物

2.1.4主要试剂

2.1.5主要仪器

2.2实验方法

2.2.1 GPMV增殖与初步纯化

2.2.2 GPMV总RNA的提取

2.2.3反转录合成cDNA

2.2.4目的基因的克隆与序列分析

2.2.5抗原表位的预测

2.2.6重组表达载体的构建

3实验结果

3.1 GPMV总RNA的提取与cDNA的合成

3.2HN、HNP、F基因的克隆及序列分析

3.2.1 PGR扩增

3.2.2重组质粒的鉴定结果

3.2.3HN、HNp、F基因的测序结果及序列分析

3.3表位预测结果

3.4 GPMV HN、HNP、F基因重组表达载体的构建

3.4.1重组质粒pProEXHTb-HN的酶切及PGR鉴定

3.4.2重组质粒pProEXHTb-HNp的酶切及PCR鉴定

3.4.3重组质粒pET-30a-F和pGEX-6P-F的酶切及PCR鉴定

4讨论

4.1HN基因遗传变异分析

4.1.1核苷酸序列的变异

4.1.2编码氨基酸的变异

4.2 F基因遗传变异分析

4.2.1核苷酸序列的变异

4.2.2编码氨基酸的变异

4.3表位的预测

5结论

参考文献

附录

攻读硕士期间发表的学术论文

致谢