Bt抗虫基因导入马铃薯的遗传转化研究

摘要

该研究通过基因工程手段,利用农杆菌介导法将Bt基因导入马铃薯品种大西洋,同时对马铃薯品种大西洋、地西瑞、东农303和克新4号的茎段和叶片再生体系进行优化,建立了马铃薯高效再生体系和遗传转化体系,探讨了影响植株再生频率和遗传转化效率的因素,确立了最佳植株再生体系和遗传转化条件,获得了转基因植株.主要研究结果如下:1马铃薯再生体系的建立(1)茎段最佳愈伤培养基为:MS+0.1 mg/l 2,4-D+1mg/l BA;最佳分化培养基为:MS+1mg/l GA<,3>+1mg/l ZT.叶片最佳愈伤培养基为:MS+0.2mg/NAA+5mg/l GA<,3>+2.25mg/l BA;最佳分化培养基为:MS+5mg/l GA<,3>+2.25mg/l BA.(2)基因型不同,在相同侵染条件下的愈伤诱导率差异较大.大西洋的愈伤率最高,茎段为68.76﹪,叶片达75.11﹪.(3)以相同的农杆菌菌株介导不同类型外植体,外植体分化率不同.该试验采用茎段和叶片作为遗传转化的外植体材料,最佳外植体为叶片.2遗传转化影响因素探讨(1)茎段外植体最佳预培养时间为2d,此时抗性愈伤率最高,为56.78﹪.最佳共培养时间为2d,抗性愈伤率最高为50.10﹪.叶片外植体最佳预培养时间为2d,此时抗性愈伤率最高,为71.25﹪.最佳共培养时间为3d,此时抗性愈伤率最高,为70.00﹪.(2)侵染时间和菌液浓度因外植体类型而异,茎段外植体最佳侵染时间为10 min,此时抗性愈伤率最高,为54.62﹪,菌液浓度OD600=0.5时,抗性愈伤率最高为49.37﹪;(3)杀菌剂选用进口头孢噻肟钠.浓度为200mg/l时,可完全抑制菌的生长,且对外植体再生无影响.(4)抗性选择剂为卡那霉素(Kan).在不同生长阶段,选择压力不同.在愈伤形成阶段,Kan的选择压力为50mg/l;在生根阶段,Kan的选择压力为75mg/l.3抗性植株的检测试验接种转化101个叶片,获得的大西洋再生植株经PCR检测和PCR-Southern杂交检测有3株呈阳性,转化率为2.96﹪,初步证明了目的基因以整合到了马铃薯基因组中.

目录

文摘

英文文摘

1前言

研究的目的和意义

1.2文献综述

1.2.1植物遗传转化研究

1.2.2植物目的基因及其应用

1.2.3转基因植株的筛选与检测

1.2.4转基因植物安全性评价

1.2.5马铃薯遗传转化研究进展

2材料与方法

2.1材料与试剂

2.1.1植物材料

2.1.2菌株和质粒

2.1.3试剂

2.1.4仪器设备

2.2试验方法

2.2.1马铃薯再生体系的建立

2.2.2遗传转化系统的优化

2.2.3转化植株的PCR检测

2.2.4 PCR-Southern杂交（地高辛法）

3结果与分析

3.1马铃薯再生体系的研究

3.1.1不同再生培养基诱导率比较

3.1.2基因型的筛选

3.1.3外植体类型对遗传转化的影响

3.2遗传转化影响因素的研究

3.2.1预培养时间对愈伤诱导率的影响

3.2.2共培养时间对愈伤诱导率的影响

3.2.3农杆菌侵染浓度对愈伤诱导率的影响

3.2.4侵染时间对愈伤诱导率影响

3.2.5杀菌剂的筛选

3.2.6选择压力的确定

3.3抗性植株的PCR检测

3.4PCR-Southern杂交

4讨论

4.1外植体类型对遗传转化的影响

4.2预培养和共培养时间对遗传转化的影响

4.3侵染时间和菌液浓度的确定

4.4抑菌剂的选择和浓度的确定

4.5基因型的差异

4.6转化植株的检测

5结论

参考文献

附录 缩写词及其英汉对照

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

图版