重组DEV gH与UL24基因杆状病毒构建及gH与UL24蛋白细胞定位

摘要

本文对重组DEV gH与UL24基因杆状病毒构建及gH与UL24蛋白细胞定位进行了研究。主要内容如下： 1.重组DEVgH与UL24基因杆状病毒的构建：根据己发表的DEVgH与UL24基因序列，设计引物p1/p2、p3/p4与p5/p6并以DEV核酸为模板克隆gH(2505bp)与UL24(1230bp)基因。其中将gH基因分为互相重叠的两个片段gH1与gH2，用引物p1/p2扩增gH1基因并将该基因连接pMD18-T载体构建克隆载体pMD18-T-gH1；引物p3/p4扩增gH2基因。用Xho Ⅰ与SfcⅠ双酶切pMD18-T-gH1，SfcⅠ与Kpn Ⅰ双酶切gH2，最后将这两段酶切产物与DBlueBacHis2A连接，成功构建了重组杆状病毒转移载体pBlue-gH。用p5/p6扩增UL24基因并将该基因连接pMD18-T载体构建克隆载体pMD18-T-UL24，用Xho Ⅰ与EcoR Ⅰ双酶切DMD18-T-UL24，将酶切产物与pBlueBacHis2A连接，构建重组杆状病毒转移载体DBlHe-UL24。分别将鉴定为阳性的重组质粒纯化，与线性化的杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞，经3轮蚀斑筛选，获得了纯化的重组杆状病毒。 2.gH蛋白细胞定位：将gH基因扩增产物连接pMD18-T构建克隆载体pMD18-T-gH，并与真核表达载体pcDNA3.1(+)分别用HindⅢ与EcoR Ⅰ双酶切，构建重组真核表达载体pcDNA-gH。将纯化的阳性重组质粒用脂质体法转染293细胞，并用该纯化质粒免疫BALB/c鼠以制备抗gH蛋白血清。间接免疫荧光试验表明，实现了DEVgH蛋白在体外的瞬时表达，并发现该蛋白定位于细胞外膜。将转染细胞用Trizol法提取细胞总RNA，gH基因特异性引物进行RT-PCR检测，结果出现目的条带，进一步证明了gH蛋白在体外的表达。 3.UL24蛋白细胞定位：根据己发表的UL24基因序列，设计引物p7/p8以DEV核酸为模板进行扩增。将扩增后的目的基因亚克隆至pEGFP-C1载体中，构建重组表达载体pEGFP-UL24，将鉴定为阳性的重组质粒纯化并用脂质体法转染293细胞。用荧光显微镜观察pEGFP-UL24在体外表达，且观察UL24蛋白定位于细胞核。将转染细胞用Trizol法提取细胞总RNA，UL24基因特异性引物进行RT-PCR检测，结果出现特异性的条带，进一步证明了UL24蛋白在体外的表达。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1鸭肠炎病毒研究进展

1.1.1历史

1.1.2病原学

1.1.3流行病学

1.1.4 DEV人工感染鸭体内分布规律

1.1.5分子生物学特性

1.1.6诊断

1.1.7疫苗研制

1.2 α疱疹病毒gH与UL24蛋白研究进展

1.2.1α疱疹病毒gH蛋白研究进展

1.2.2α疱疹病毒UL24蛋白研究进展

1.3研究的目的与意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1病毒与细胞

2.1.2鸡胚与实验动物

2.1.3载体

2.1.4生物学试剂

2.1.5引物设计

2.1.6主要仪器

2.2实验方法

2.2.1 DEV目的基因的克隆

2.2.2重组gH与UL24基因杆状病毒的构建

2.2.3 gH蛋白细胞定位

2.2.4 UL24蛋白细胞定位

3结果

3.1 DEV目的基因的克隆

3.2重组质粒pMD18-T-gH1与gH2基因片段的鉴定

3.2.1重组质粒pMD18-T-gH1的鉴定

3.2.2 gH2基因片段的鉴定

3.3重组质粒pMD18-T-UL24的鉴定

3.4重组DEV gH与UL24基因杆状病毒的构建

3.4.1重组质粒pBlue-gH的鉴定

3.4.2重组质粒pBlue-UL24的鉴定

3.4.3重组质粒pBlue-gH与pBlue-UL24的纯化

3.4.4昆虫细胞的转染及重组病毒筛选

3.4.5重组病毒的PCR检测

3.5 gH蛋白细胞定位

3.5.1重组质粒pMD18-T-gH的鉴定

3.5.2重组质粒pcDNA-gH的鉴定

3.5.3重组质粒pcDNA-gH的纯化

3.5.4重组质粒pcDNA-gH瞬时表达的间接免疫荧光检测

3.5.5重组质粒pcDNA-gH瞬时表达的RT-PCR检测

3.6 UL24蛋白细胞定位

3.6.1 PCR反应克隆UL24基因

3.6.2重组质粒pMD18-T-UL24的鉴定

3.6.3重组质粒pEGFP-UL24的鉴定

3.6.4重组质粒pEGFP-UL24的纯化

3.6.5重组质粒pEGFP-UL24瞬时表达的荧光检测

3.6.6重组质粒pEGFP-UL24瞬时表达的RT-PCR检测

4讨论

4.1 gH基因分段克隆策略

4.2重组DEV gH与UL24基因杆状病毒的构建

4.2.1杆状病毒表达系统的选择

4.2.2重组DEV gH基因杆状病毒

4.2.3重组DEV UL24基因杆状病毒

4.3脂质体转染

4.3.1细胞

4.3.2血清

4.3.3 DNA质量

4.4 DEV gH蛋白细胞定位

4.4.1 pcDNA3.1载体的选择

4.4.2 DEV gH蛋白的细胞定位

4.5 DEV UL24蛋白细胞定位

4.5.1 pEGFP-C1载体的选择

4.5.2 DEV UL24蛋白的细胞定位

5结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文