乳酸杆菌pPG质粒表达系统理想表达条件的探索

摘要

相对于大肠杆菌原核表达系统，乳酸菌表达系统还不够成熟，主要表现在外源蛋白的表达量较低、乳酸菌的某些遗传背景不够清楚，操作比较繁琐，表达条件相对不够稳定等，因此探索乳酸菌载体系统适宜的表达条件，提高表达量，建立乳酸菌表达系统的技术平台，对表达的外源蛋白更有效的发挥作用具有重要的实践意义。 本试验对乳酸杆菌pPG质粒表达系统理想表达条件进行了探索，以干酪乳杆菌 Lactobacillus casei 393为宿主菌，β-葡萄糖苷酸酶(gusA)基因作为表达的报告基因，探索了其表达过程中诱导物种类、诱导物浓度、诱导时间、培养基pH、培养方式等各个影响表达的关键因素进行了研究。试验结果表明，活化的种子菌以1％接种于MRS液体培养基，并用1％乳糖为诱导物，初始培养基pH值在6.0～7．0之间，30℃或32℃，静止培养约7～8小时，菌液浓度至A<,590>OD达0.5，表达效率最高，外源蛋白的表达量可占菌体总蛋白的14％。分泌表达载体干酪乳杆菌pPG-2-/L.393上清液分别经4℃透析和冷冻干燥浓缩50倍后，West blot未检测到目的蛋白，而将pPG-2/L.393的菌体沉淀经West blot检测后出现明显的目的带，由此说明干酪乳杆菌pPG-2/L.393表达的gusA目的蛋白仍结合在菌体上：培养基中葡萄糖的浓度对gusA的表达有抑制作用。当葡萄糖终浓度为0.1％以下时对pPG-1/L.393表达gusA未见明显影响，而当其含量达到0.5％时，表达量明显下降，至葡萄糖浓度达到2％时，基本看不到gusA的表达。试验通过对乳酸杆菌pPG质粒表达系统理想表达条件的探索为更好利用该系统表达活性蛋白(肽类)奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1乳酸杆菌质粒及表达载体

1.1.1乳酸杆菌质粒及人工构建的质粒载体

1.1.2乳酸杆菌的电转化

1.1.3乳酸杆菌食品级表达载体

1.2乳酸杆菌表达外源蛋白的研究进展

1.2.1乳酸杆菌外源蛋白表达系统

1.2.2外源蛋白表达产物的运输与定位

1.2.3重组乳酸杆菌表达外源抗原的免疫效果

1.3乳酸杆菌作为黏膜免疫活载体疫苗的相关特性

1.3.1乳酸杆菌的黏附性和定植能力

1.3.2乳酸杆菌的体外黏附

1.3.3免疫原性和佐剂性

1.3.4抗原口服提呈的优点

1.4乳酸菌表达外源基因存在的问题及应用前景

1.5本研究的目的及意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1菌种与质粒

2.1.2抗体制剂

2.1.3试剂及试剂配制

2.1.4主要仪器设备

2.2试验方法

2.2.1干酪乳杆菌表达gusA条件的探索

2.2.2表达产物的SDS-PAGE分析

2.2.3免疫印记(West blot)分析

3结果

3.1不同诱导物诱导pPG-1/L.393表达gusA的SDS-PAGE和West blot检测结果

3.2不同浓度乳糖诱导后的电泳结果

3.3不同温度对表达量影响的试验

3.4不同诱导时间的菌液浓度对表达量的影响

3.5葡萄糖浓度对乳糖诱导表达的抑制试验

3.6培养基不同初始pH值对gusA表达量的影响

3.7摇振培养与静止培养对表达量的影响

3.8干酪乳杆菌pPG-2/L.393表达产物的West blot检测结果

4讨论

4.1有关干酪乳杆菌pPG质粒表达系统表达量和影响表达的条件

4.2乳酸菌分泌型表达载体系统pPG-2/L.393 gusA的表达位置

4.3葡萄糖在pPG表达系统中对gusA表达的影响

4.4乳酸杆菌的转化与裂解

5结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文