野猪、家猪ACSL4基因的克隆、表达及多态性研究

摘要

脂肪含量是影响肉质的重要指标，是目前猪育种工作的重点，其合成和分解过程中的限速酶的活性影响着脂肪的沉积。酰基辅酶A合成酶长链4(Acly-CoAsynthetaselongchainfamily4，ACSL4)在脂肪酸代谢过程中起着关键的作用，通过两个步骤催化游离的脂肪酸和辅酶A，在ATP和镁离子的存在下生成脂肪酰基辅酶A合成酶，参与脂肪酸的合成和分解代谢过程。本研究以野猪、家猪和野家杂交猪利用比较基因组学和生物信息学方法对ACSL4基因全长编码区进行了结构分析及进化分析；利用RT-PCR方法进行了ACSL4的组织表达分析；利用PCR-SSCP方法进行了猪(品)种间多态性分析。主要研究结果如下： 1.首次克隆了野猪ACSL4基因的全长编码区序列(GenBankaecessionNo:EU553523)，和大白猪的该基因及部分序列(GenBankaccessionNo:EF641277)，野猪和大白猪在编码区上存在着3个碱基的变异(A1015G、T1468C、T1469C)，在氨基酸水平上存在着2个氨基酸(R339G、F490P)变异。生物信息学分析发现，在多肽链的234-245位置处存在一个潜在的AMP结合位点，表明ACSL4基因是受腺苷酸结合蛋白调控的。利用邻接法构建了ACSL4基因的分子进化树，其中，猪与牛同源性较高，与鸡的变异程度较大，处于进化树的最外围。基因组结构分析表明，猪ACSL4基因含有14个外显子和13个内含子。 2.利用RT-PCR方法构建了ACSL4基因在野猪、大白猪和野家杂交猪中的组织表达谱，结果表明该基因在猪肌肉、子宫、肾、脾、心和肺中表达；对ACSL4基因在大白猪和野家杂交猪同一组织中表达的比较研究表明，在肾、脾、肺、心、子宫和肌肉等组织中，大白猪的表达量要高于野家杂交猪。 3.PCR-SSCP分析发现，在ACSL4基因的外显子8、11和14上存在着4个点突变，引起了蛋白质多肽链上R339G、F490P、G656W氨基酸的变化；在3'UTR区检测到两个突变位点。群体遗传学分析发现，所检测到的多态位点基因型频率分布与品种相关联。

目录

文摘

英文文摘

声明

1.前言

1.1ACSL4基因的研究进展

1.1.1ACSL4基因的主要生物学功能

1.1.2ACSL4基因与脂肪酸代谢关系的研究

1.1.3ACSL4基因与疾病

1.2脂肪酸的研究进展

1.2.1脂肪酸的种类和营养功能

1.2.2猪肌肉脂肪酸的研究进展

1.2.3脂肪酸与肉质关系的研究

1.2.4野家杂交猪和家猪肌肉脂肪酸含量的差异研究

1.3本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验动物

2.1.2组织样本采集

2.1.3主要仪器设备

2.1.4主要药品及试剂

2.1.5工具酶及试剂盒

2.2实验方法

2.2.1耳组织样DNA提取及检测

2.2.2组织样总RNA的提取及检测

2.2.3引物设计与合成

2.2.4野猪和大白猪ACSL4基因的克隆

2.2.5猪ACSL4基因部分内含子的克隆

2.2.6半定量RT-PCR的分析

2.2.7 PCR-SSCP检测

3结果与分析

3.1猪ACSL4基因的克隆、序列分析

3.1.1野猪ACSL4基因的克隆

3.1.2大白猪ACSL4基因的克隆

3.1.3猪ACSL4基因部分内含子的克隆

3.1.4猪ACSL4基因的结构、功能域分析

3.1.5 ACSL4基因分子进化分析

3.2猪ACSL4基因的表达特性分析

3.2.1线性增长实验

3.2.2ACSL4基因在野猪各组织中的表达

3.2.3 ACSL4基因在大白猪各组织中的表达

3.2.4.ACSL4基因在3月龄野家杂交猪不同组织中的表达

3.2.5 ACSL4基因在大白猪和野家杂交猪组织中的表达

3.3猪ACSL4基因多态性分析

3.3.1ACSL4基因单核苷酸多态性分析

3.3.2不同品种(系)猪ACSL4外显子区SNPs等位基因的基因型分布频率

4讨论

4.1猪ACSL4基因的克隆

4.2猪ACSL4基因的组织表达特性分析

4.3猪的ACSL4基因多态性分析

4.3.1 PCR-SSCP多态性实验条件分析

4.3.2多态性结果分析

5结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文