猪繁殖与呼吸综合征直接免疫荧光诊断方法的建立及其应用

摘要

本研究以临床“高热综合征”病例中分离到的高致病性PRRSV-HBR变异株接种健康仔猪制备抗血清，采用硫酸铵盐析法提取血清中免疫球蛋白(IgG)，并用异硫氰酸荧光素(FITC)对IgG进行荧光标记，通过优化反应条件，建立一种用于检测病毒感染单层细胞及动物脏器组织切片中PRRSV抗原的直接免疫荧光(DIFA)诊断方法。应用该方法检测PRRSV感染MARC-145细胞增殖动力学的结果表明，接种后16h抗原阳性细胞开始出现，于60h～72h达到病毒增殖高峰，96h后感染细胞崩解。对PRRSV人工感染猪组织脏器抗原分布的检测结果显示，腹股沟淋巴结、空肠、睾丸、脾脏、下颌淋巴结、肠系膜淋巴结和扁桃体的抗原阳性检测率较高：对来源于山东、内蒙古、吉林、黑龙江等地10个猪场的38份临床病料的PRRSV平均阳性检出率为63.2％(24/38)。该方法具有特异性强、敏感性和重复性好等特点，与RT-PCR检测结果符合率为96.3％，对几种已知猪病毒抗原无交叉反应，标记的荧光抗体于4℃保存6个月稳定。本研究为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的临床诊断提供了一种快速、敏感、特异、有效的检测手段。

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声明

1 引言

1.1猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展

1.1.1PRRSV概述

1.1.2病毒的基因组结构

1.1.3病毒基因组的转录及表达

1.1.4病毒基因组所编码的蛋白

1.2猪繁殖与呼吸综合征诊断方法研究进展

1.2.1流行病学与临床诊断

1.2.2病原学诊断

1.2.3血清学诊断

1.3研究的目的和意义

2 材料和方法

2.1实验材料

2.1.1毒株与细胞系

2.1.2实验动物

2.1.3主要试剂和溶液

2.1.4引物

2.1.5主要仪器

2.2实验方法

2.2.1猪抗PRRSV高免血清的制备

2.2.2免疫球蛋白IgG的提取

2.2.3免疫球蛋白IgG的荧光标记

2.2.4PRRSV DIFA操作程序

2.2.5PRRSV DIFA反应条件的优化

2.2.6PRRSV DIFA的特异性、敏感性、重复性及保存期试验

2.2.7PRRSV-HBR毒株增殖情况测定

2.2.7人工感染猪及临床病料的采集

2.2.8与RT-PCR方法比较试验

3 结果

3.1PRRSV DIFA反应条件的确定

3.2PRRSV DIFA的特异性、敏感性、重复性及保存期

3.3PRRSV-HBR毒株增殖情况检测结果

3.4人工感染猪及临床发病猪组织样品检测结果

3.4.1人工感染猪临床表现

3.4.2人工感染猪各组织脏器病毒检出情况及分布特点

3.4.3DlFA与RT-PCR检测符合率

3.4.4临床发病猪组织样品检测结果

4 讨论

4.1免疫荧光染色的影响因素

4.2与其它诊断方法的比较

4.3PRRSV DIFA的应用

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文