捻转血矛线虫H15 ES抗原基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立

摘要

捻转血矛线虫病是由捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）引起的寄生虫病。感染牛、羊、鹿、牦牛、骆驼等反刍动物。该病呈世界性分布。在我国各地均有报道，给畜牧业生产造成巨大的经济损失。该病主要采用化学药物治疗，但药物残留和环境污染严重。捻转血矛线虫对驱虫药普遍具有抗药性，并且感染后通常不表现明显的临床症状。为了有效控制该病，快速准确的检测方法和预防接种显得尤为重要。
　　 本实验根据GenBank中已发表的序列（U64792）为参考设计并合成引物，应用RT-PCR方法扩增捻转血矛线虫H15 ES抗原基因，并进行了克隆与序列分析。实验结果表明，H15 ES抗原基因全长为453bp，包含完整的开放阅读框，编码148个氨基酸残基。所得序列与GenBank已知序列核苷酸同源性为99.78％，氨基酸同源性为100％。
　　 利用生物信息学软件和网络平台对H15 ES抗原蛋白进行了理化性质、二级结构、亲水性、柔韧性及表面可能性、抗原性进行了分析，综合评价了H15 ES抗原蛋白的抗原特异性细胞表位，并计算出一些潜在的抗原位点；Psort 分析显示该蛋白定位于细胞质的可能性为66.7％，ProtFun预测提示该蛋白为酶的可能性为0.361，该蛋白具有信号转导、免疫应答、应激应答功能的可能性较高。
　　 利用PCR技术，从pMD18-T-H15ES重组质粒中扩增H15 ES抗原基因片段，重组到原核表达载体pET32a(+)中。将重组原核表达载体pET32a-H15 ES转入大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导，由SDS-PAGE电泳分析证实H15 ES基因获得了表达，重组蛋白分子量大约是35.2ku，该重组蛋白以包涵体的形式存在。经Westen-blot分析证实表达的重组蛋白具有良好的抗原性。
　　 通过Ni-NTA系统对H15 ES重组蛋白进行纯化，以纯化的重组蛋白作为检测抗原建立间接ELISA检测方法。矩阵试验确定最适包被浓度为2μg/ml，血清的最佳稀释度为1：200，ELISA阳性反应的临界值为OD450nm=0.203。
　　 本研究为捻转血矛线虫病诊断抗原和保护性抗原的大量制备及捻转血矛线虫核酸疫苗的研究奠定基础。