连接粘附分子2在小鼠早期妊娠子宫中的表达、调节与功能

摘要

哺乳动物胚胎的成功着床需要具有黏附能力的活性囊胚和具有接受能力子宫内膜之间成功的建立分子对话，并进行进一步的相互作用，着床过程可分为定位、黏附和侵入三个阶段。胚胎的着床过程受到卵巢分泌的类固醇激素雌激素和孕酮的控制，雌激素和孕酮协同调节子宫细胞的增殖和分化，时空特异性地控制子宫着床窗口的打开。本研究室利用基因芯片分析发现连接粘附分子2在小鼠早期妊娠第3天和第4天有高表达，提示该分子在小鼠胚胎着床窗口的开放中可能起到重要作用。连接粘附分子家族属于免疫球蛋白超家族，是细胞粘附分子中的一员，我们利用原位杂交、免疫组织化学、Real-time PCR、Western blot、胚胎黏附分析以及子宫角抗体注射等方法，对连接粘附分子家族特别是Jam2在小鼠早期妊娠子宫中的表达、调节及功能进行了深入的研究。
　　 Jam2 mRNA在早期妊娠第1天和第2天的小鼠子宫中基本没有表达，在第3天和第4天腔上皮有强表达，在腺上皮弱表达，在第5天Jam2 mRNA的信号较弱，在早期妊娠第7天和第8天的小鼠子宫系膜侧的血管内皮细胞有强表达。Jam2蛋白的表达模式与mRNA类似，不同的是第3天子宫腔上皮的表达较弱而只有第4天表达很强，在第4天中午12:00到下午16:00 Jam2蛋白的表达最强。在第5天着床点的腔上皮还有少量蛋白的表达，在第7天和第8天的小鼠子宫系膜侧的血管内皮细胞同样有强表达。使用Real-time PCR和Western blot得到的定量分析结果与上述定位分析基本一致。
　　 Jam2在早期妊娠子宫中的表达受到孕酮诱导，卵巢切除的小鼠子宫中Jam2 mRNA和蛋白的表达在孕酮处理后6-12 h后被明显诱导。使用孕酮受体拮抗剂米非司酮（RU486）可以抑制孕酮对Jam2的诱导，说明孕酮可以通过其核受体PR诱导Jam2的表达。RU486处理早期妊娠第4天的小鼠可以抑制子宫中Jam2 mRNA和蛋白的表达，说明早期妊娠中体内Jam2的表达也是受到孕酮及其核受体的调节的。进一步研究发现转录因子Msx1介导了孕酮对Jam2表达的调节，Msx1在卵巢切除和早期妊娠的小鼠子宫中都受到孕酮及其核受体的调节，使用电穿孔的方法在体外培养的小鼠子宫内膜腔上皮组织中过表达Msx1，可以上调Jam2的表达。
　　 另外，我们发现雌激素可以在短时间内上调卵巢切除小鼠子宫中Jam2的表达，其下游分子LIF也可以通过激活信号转导与转录激活因子Stat3的磷酸化从而促进Jam2表达的上调。使用LIF或Stat3磷酸化抑制剂处理均可影响腔上皮组织中Jam2的表达，通过电穿孔的方法将持续活化的c-Stat3载体导入体外培养的小鼠子宫内膜腔上皮组织中也可以明显上调Jam2的表达。
　　 黏附分析的结果证明，包被重组Jam2蛋白可以促进酶标板底部孵化胚胎的黏附，而可溶性的重组Jam2蛋白和重组Jam3蛋白可以抑制这种促进作用。在体内实验中，注射Jam2抗体的子宫角着床胚胎数量远低于注射山羊IgG的对照侧，表明Jam2可以促进胚胎和子宫内膜腔上皮之间相互作用。这些结果说明Jam2可能通过介导孵化胚胎在子宫内膜腔上皮上的黏附促进了胚胎着床的过程。
　　 我们的结果表明，孕酮通过转录因子Msx1诱导Jam2在小鼠子宫接受期腔上皮中的表达，而雌激素及其下游LIF-Stat3通路也可以促进.Jam2的表达。Jam2通过与胚胎滋养层细胞表达的配体相互作用促进了胚胎的定位、与子宫内膜的黏附。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS英文目录

1 引言

1.1 胚胎着床研究概况

1.1.1 胚胎着床的必要条件

1.1.2 胚胎着床过程中的类吲醇激素

1.2 细胞粘附分子

1.2.1 细胞粘附分子的分类

1.2.2 细胞粘附分子与胚胎着床

1.3 JAM家族的成员、结构特征、表达及定位

1.3.1 JAM家族成员

1.3.2 JAMs的结构特征

1.3.3 JAMs的表达及定位

1.4 JAM蛋白的作用方式

1.4.1 同亲性相互作用

1.4.2 异亲性相互作用

1.5 JAM家族成员的功能

1.5.1 细胞连接的装配和稳定

1.5.2 JAM家族成员在炎症反应中的作用

1.5.3 JAM家族成员与血小板激活

1.5.4 JAM家族成员与血管发生

1.6 JAM家族成员与哺乳动物生殖

1.6.1 JAMs与雄性生殖

1.6.2 JAMs与雌性生殖

1.7 胚胎着床与炎症反应中白细胞渗出的相似性

1.8 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 实验动物模型

2.2.1 早期妊娠模型

2.2.2 假孕模型

2.2.3 延迟着床与延迟着床激活模型

2.2.4 类同醇激素处理模型

2.2.5 小鼠子宫内膜腔上皮的分离

2.3 原位杂交探针的制备

2.3.1 探针引物设计及合成

2.3.2 提取总RNA

2.3.3 消化残留的DNA

2.3.4 反转录

2.3.5 PCR反应

2.3.6 扩增产物的回收及载体连接

2.3.7 感受态细胞的制备

2.3.8 重组质粒的转化、测序及方向鉴定

2.3.9 cRNA片段的体外转录和地高辛标记

2.4 原位杂交

2.4.1 载玻片的处理

2.4.2 冰冻切片方法

2.4.3 试剂及溶液的配制

2.4.4 原位杂交流程

2.5 免疫组织化学

2.5.1 冰冻切片的制备

2.5.2 免疫组织化学流程

2.6 Real-time PCR

2.6.1 总RNA的提取

2.6.2 引物序列

2.6.3 Real-time PCR

2.7 体外培养子宫内膜腔上皮的处理

2.7.1 LIF处理

2.7.2 Sta3磷酸化抑制剂处理

2.7.3 孕酮处理

2.8 真核过表达载体的构建

2.8.1 Msx1真核表达载体系统的构建

2.8.2 持续激活的c-Stat3 Flag cRC/CMV载体

2.9 电穿孔实验

2.10 Western Blot

2.10.1 样品的提取

2.1 0.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.10.3 免疫印记及显影

2.10.4 相关药品和溶液的制备

2.11 胚胎黏附实验

2.11.1 r-mJam2重组蛋白的包被

2.11.2 孵化囊胚的获取

2.11.3 黏附实验及结果的判定

2.11.4 可溶性重组蛋白对胚胎黏附的影响

2.11.5 相关溶液的配制

2.12 在早期妊娠小鼠子宫角内注射抗体

3 实验结果

3.1 Jam2在小鼠早期妊娠子宫中的表达

3.1.1 Jam2在小鼠早期妊娠子宫中的定位表达

3.1.2 Jam2在小鼠早期妊娠子宫中的定量表达

3.1.3 Jam2在假孕小鼠子宫中的表达

3.1.4 Jam2在小鼠子宫延迟着床和延迟着床激活模型中的表达

3.1.5 Jam2在激素处理模型中的表达

3.2 孕酮对小鼠子宫中Jam2表达的影响

3.2.1 孕酮对卵巢切除小鼠子宫中Jam2表达的影响

3.2.2 孕酮对体外培养的子宫内膜腔上皮中Jam2表达的影响

3.2.3 RU486影响外源性孕酮诱导的Jam2上调

3.2.4 RU486影响内源性孕酮诱导的Jam2上调

3.3 转录因子Msx1对小鼠子宫腔上皮中Jam2表达的影响

3.4 雌激素对小鼠子宫中Jam2表达的影响

3.5 LIF及Stat3对小鼠子宫腔上皮中Jam2表达的影响

3.5.1 LIF对小鼠子宫腔上皮中Jam2表达的影响

3.5.2 Stat3磷酸化抑制剂对小鼠子宫腔上皮中Jam2表达的影响

3.5.3 Stat3持续激活对小鼠子宫腔上皮中Jam2表达的影响

3.6 Jam2对小鼠孵化囊胚粘附的影响

3.7 子宫角注射Jam2抗体对胚胎着床的影响

3.8 着床前胚胎中Jam2 mRNA的表达

3.9 其他JAM家族及其相关分子mRNA以及CD31的表达

3.9.1 Jam1的表达

3.9.2 Jam3的表达

3.9.3 Jam4的表达

3.9.4 Esam的表达

3.9.5 Cxadr 的表达

3.9.6 内皮细胞标志分子CD31的表达

4 讨论

4.1 孕酮及其下游通路诱导Jam2的表达

4.1.1 Jam2表达受到孕酮的诱导

4.1.2 转录因子Msx1介导孕酮对于Jam2的诱导

4.2 雌激素及下游通路调节Jam2的表达

4.2.1 LIF促进小鼠子宫腔上皮组织中Jam2的表达

4.2.2 Stat3磷酸化促进小鼠子宫腔上皮组织中Jam2的表达

4.3 Jam2与胚胎的定位与粘附

4.3.1 Jam2促进胚胎黏附到子宫内膜腔上皮上

4.3.2 Jam2促进胚胎黏附的可能机制

4.4 JAM家族成员的表达与小鼠早期妊娠

4.4.1 JAM家族成员与母体子宫-胚胎之间的免疫屏障

4.4.2 JAM家族成员在小鼠早期妊娠子宫中的血管内皮中的作用

5 结论

致谢

参考文献

图版

攻读博士学位期间发表的学术论文